适配体生物传感器在病原微生物检测中的应用

摘 要 适配体是通过指数富集系统进化技术（SELEX）体外筛选得到的一类能够特异性地结合小分子物质、蛋白, 甚至整个细胞的寡核苷酸序列。由于具有制备简便、易于修饰、稳定性好等特点, 适配体已广泛应用于构建生物传感器, 实现对病原微生物的识别和检测。本文在阐述适配体基本原理的基础之上, 结合近年来病原微生物适配体研究领域的最新研究成果, 综述以病原微生物为目标的适配体筛选技术的最新进展；列举目前已经筛选获得的病原微生物（原生生物、病毒、细菌）适配体；综述适配体生物传感器在病原微生物检测中的应用。并展望了适配体生物传感器在病原微生物检测领域的发展趋势。

关键词 适配体； 病原微生物； 检测； 生物传感器； 评述

1 引 言

病原微生物是一类引起人类与动植物各种疾病的微生物, 包括原生生物、病毒和细菌。常见的病原微生物有疟原虫、人类免疫缺陷病毒、大肠埃希氏杆菌、伤寒沙门氏菌等。每年它们给人类和各种动植物的健康造成了极大的危害, 带来了巨大的经济损失\。因此, 迫切需要研发快速、灵敏和低成本的检测方法, 以监测和控制它们在食品和环境中的传播。传统的病原微生物检测方法首先通过分离培养, 然后进行一系列复杂繁琐的生化测试检测样品中的微生物\。这种检测方式虽然具有很高的灵敏度和特异性, 但是需要的时间较长（通常需要5～7 d）, 因而不适用于快速现场检测。近年来, 生物传感器由于具有快速、灵敏、特异性高、成本低的优点, 而被广泛运用于病原微生物的检测\。生物传感器是利用分子识别元件和待测病原微生物的特异性结合产生的生物学信息, 通过转换器转化为电、光等物理信号输出, 从而达到分析检测的目的\。常见的分子识别元件为抗体, 抗体具有高亲和性、高特异性, 基于抗体的生物传感器目前已被广泛的研发。但是抗体具有一些自身的局限性, 如针对某种目标物的抗体需要一系列繁琐复杂的体内筛选过程, 因而实验周期长, 成本高, 同时抗体容易变性, 对检测环境的要求较高\。因此, 需要研发一种新的分子识别元件, 不仅具有抗体的高特异性, 同时又能克服抗体存在的缺点, 应用于病原微生物检测。

适配体是一类在体外筛选的, 能与相应目标物专一并紧密结合的一类单链寡核苷酸序列\。在生物传感器的构建方面, 适配体具有一些优于抗体的优点：（1）适配体是通过体外筛选, 适配体SELEX筛选周期一般为2～3个月, 最快的只需2周, 而制备单克隆抗体则至少需要3～6个月, 且成本昂贵；（2）适配体是通过化学法合成的, 因而可以在适配体上灵活修饰多种基团, 使其具有多种功能；（3）抗体的蛋白本质决定了它容易变性, 传统免疫生物传感器化学和物理性质的不稳定限制了生物传感器的应用范围, 而适配体具有化学稳定性, 在pH 2～12的宽范围内保持稳定, 并具有一定的热复性；（4）适配体组成简单, 一般由几十个核苷酸（少于100 nt）组成, 因而适配体的设计相对简单。由于适配体拥有抗体无法比拟的优势, 利用适配体设计生物传感器对病原微生物进行识别和检测, 具有极其重要的意义\。

2 病原微生物核酸适配体的SELEX筛选方法

SELEX技术是筛选特异性适配体的通用过程, 主要有5步（图1）：结合、分离、洗脱、扩增和调节。首先将包含有1013～1015个随机序列的核苷酸序列库（ssDNA文库、RNA文库）与靶分子混合温育, 随后通过物理方法分离出结合了靶分子的核苷酸序列。洗脱收集获得结合序列, 并将结合序列进行聚合酶链式反应（PCR）扩增生成次级文库, 用于下轮筛选。一般通过6～20轮SELEX循环, 对已达到高亲和力的扩增产物进行克隆测序, 从而获得特异性识别靶分子的适配体\。对于筛选病原微生物适配体的SELEX过程, 最关键的两个步骤为筛选适配体靶分子的选择和结合序列的分离。

图1 SELEX 技术流程图\

Fig．1 Schematic of systematic evolution of exponential enrichment （SELEX） technique\

2.1 筛选适配体的靶分子

病原微生物为生物大分子, 具有复杂的靶结构。筛选适配体的靶分子常为病原微生物细胞表面某个特定纯化蛋白\、病原微生物细胞的裂解物\或者是完整的细胞\。

目前, 大部分适配体的筛选是选择纯化的可溶性蛋白作为靶分子。这是因为纯化的蛋白成分单一, 能够保证每个循环中与核酸结合的蛋白结构的稳定性, 提高SELEX筛选的效率\。但是, 使用纯化蛋白作为靶分子也存在一些缺点。首先, 被筛选的纯化蛋白分子不能保持其在完整细胞中的天然构象, 从而引起筛选出来的适配体与完整细胞的结合力减弱；其次, 有些纯的靶蛋白不易获得, 特别是当筛选的目标物未知时, 以纯化的某种特定蛋白作为靶分子筛选适配体会更加困难。

研究构成复杂的病原微生物需要一种针对复合靶的筛选方法。微生物适配体筛选多采用完整的细胞作为复合靶分子, 但这种复合靶分子通常会带来靶分子位点多、不易筛选出高特异性核酸适配体的问题。为了解决该问题, 通常使用两种或多种同源微生物, 用于反向、消减筛选步骤, 以得到针对目标微生物的具有高特异性的适配体\。Cao等以完整的金黄色葡萄球菌作为靶分子进行筛选, 为了提高筛选适配体的特异性, 而使用链球菌和表皮葡萄球菌进行消减筛选。经过多轮筛选, 得到11条对金黄色葡萄球菌具有特异性的适配体, 并且证明多条适配体联合使用比单一的适配体对金黄色葡萄球菌的特异性更高\。

2.2 结合序列的分离

有效去除未结合的寡核苷酸是适配体筛选过程中的关键步骤之一, 对筛选适配体的结合特性有极大影响。良好的分离方法可以有效减少筛选的循环次数, 提高筛选适配体的特异性和亲和性。由于靶分子为蛋白或完整细胞, 属于生物大分子, 常用的分离结合序列的方法有过滤法\、离心法\、磁珠分离法。以上几种方法虽然可以将病原微生物结合复合物与未结合核苷酸序列分离, 但是分离的同时不能得到病原微生物与核苷酸序列的亲和信息, 而需要后续繁琐的测试过程。目前, 一些新的分离技术, 如毛细管电泳技术\、表面等离子共振\、流式细胞术等, 已逐步用于分离病原微生物结合复合物与未结合核苷酸序列, 这些方法在实现分离的同时还可以评估微生物与核酸序列的亲和性, 使得适配体的筛选过程变得相对简便。毛细管电泳的原理是基于不同组分间荷质比差异导致的电泳迁移率不同而进行分离。当靶分子与其适配体亲和作用足够强, 形成的复合物足够稳定时, 在合适的分离和检测条件下, 可分别得到游离的寡核苷酸与复合物的电泳峰\。毛细管电泳技术具有分离速度快、分辨率高、操作简单、样品用量少和研究成本低等明显优势, 在这个领域已显示出巨大的潜力。此外, 表面等离子共振、流式细胞术等近年来在适配体的筛选分离中也有所应用。这些方法不仅能高效分离结合序列, 更能同时测定筛选出的核苷酸与靶分子的亲和能力, 简化了SELEX的步骤, 在适配体筛选领域具有十分重要的意义。

3 病原微生物的适配体

3.1 原生生物适配体

锥虫是一类重要的病原微生物, 它可寄生在多种温血动物和冷血动物中, 给人类和动物的健康造成了极大的危害。最早筛选出的锥虫适配体是布氏锥虫适配体。Homann等\使用布氏锥虫的完整细胞作为目标靶分子, 筛选出3类共22条不同序列的RNA适配体, 能特异性地识别布氏锥虫细胞表面的鞭毛蛋白。随后, Ulrich等\又筛选出另一种锥虫――克氏锥虫的适配体, 获得4类共23条RNA适配体, 该适配体能特异地与克氏锥虫表面识别宿主细胞的位点结合。

3.2 病毒适配体

目前, 筛选获得的病毒适配体主要的是人类免疫缺陷病毒（HIV）\、肝炎病毒\、流感病毒\、非典型性肺炎病毒（SARS）\的适配体（表1）。人类免疫缺陷病毒属于慢病毒属, 是一种潜伏期极长的逆转录病毒。针对HIV表面的不同蛋白, 包括结构蛋白RT（p50逆转录酶）\、结构蛋白gp120\、调控蛋白Tat\, 分别筛选出3种可以与HIV特异并高亲和性结合的适配体。而肝炎病毒是适配体筛选的另一大类病毒, 它是引起病毒性肝炎的病原体。Fukuda和Biroccio分别以丙肝病毒（HCV）的非结构蛋白NS3\和NS5\为靶分子, 筛选出针对HCV的适配体。流感病毒是一类容易大范围流行的病毒。