富硒蛹虫草的筛选及其耐硒特征的研究

摘 要：该文通过实验筛选出一株发酵周期短、菌丝体产量及富硒量较高的优质菌株北冬虫夏草1，研究冬虫夏草的耐硒特征。结果表明，在摇瓶培养过程中，北冬虫夏草的耐亚硒酸钠浓度为12μg/mL时，其生物量达到12.01g/L，富硒量达到4.635μg/mL，富硒率达到385.92μg/g。研究富硒北冬虫夏草的生长过程曲线，了解到当培养时间为72h左右时，其生物量最大且此时的富硒效果最好。

关键词：北冬虫夏草；亚硒酸钠；硒含量测定；生长曲线

中图分类号 TS213.2 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）19-0037-02

Abstract：The selenium- enriched Cordyceps was screened， and the mutant Cordyceps 1 was obtianded. Fermentation conditions were investigated，the concentration of sodium selenite resistant 12μg/ml.Under the optimized conditions， the selenium content of the cells was up to 12.01g/L，Se amount was up to4.635μg/ml， selenium-riched rate was up to 385.92μg/g. The growth curve of cordyceps shows when the incubation time was about 72h， the biomass is the largest and the effect of selenium- enriched is the best.

Key words：Cordyceps；Selenite；Determination of selenium content；Growth curve

北冬虫夏草（蛹虫草）生活史的有性阶段包括菌丝体生长和子实体生长[1]。鳞翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫幼虫把蛹草拟青霉的孢子食入体内，还可以自由活动，即为“冬虫”，当条件适宜时，孢子便萌发形成菌丝体，菌丝体吸取虫蛹的营养作为其生长发育的物质和能源[2]。

硒是人体必需的微量元素之一，研究发现，硒尤其是有机硒具有预防心脑血管疾病、抗肿瘤、提高免疫力、促进人体生长发育等作用，人体缺硒会导致多种疾病。据硒盐的毒理分析表明，无机硒均为剧毒，且不易被人体吸收，而有机硒化合物毒性远低于无机硒化合物，且生物利用率高[3]。通过人工方法将无机硒转化成有机硒，具有普遍的食用和保健价值。无机硒在虫草体内通过菌丝细胞内物质的代谢，结合到大分子活性物质（如多糖和蛋白质）上，转化为有机硒多糖和硒蛋白，从而发挥了硒和虫草固有的以及协同的生理作用，使其具有无毒、安全、高效的生理活性，进而为开发天然的富硒蛹虫草提供科学的理论依据[4]。

1 材料与方法

1.1 菌种与试剂

1.1.1 菌种 供试蛹虫草（Cordyceps militaris）为本实验室保藏菌种，各菌株编号：蛹虫草1，蛹虫草2，蛹虫草3。

1.1.2 试剂 土豆，黄豆，玉米粉（均购自同达森客超市）；葡萄糖，果糖，麦芽糖，蔗糖，磷酸二氢钾，硫酸镁，硝酸铵，氯化铵，硫酸铵（均为分析纯），蛋白胨，酵母粉，实验室已具有。酵子：玉米面活性干酵母。

1.2 仪器与设备 KDM型控温电热套（山东鄄城华鲁仪器公司），生化培养箱（上海跃进医疗器有限公司，型号 SPX-250），手提式蒸汽灭菌器（江阴滨江设备有限公司），超净工作台（上海智诚分析仪器制造有限公司，型号 ZHJH-C1112B），恒温震荡培养器（上海智诚分析仪器制造有限公司，型号ZWY-100D）。

1.3 蛹虫草富硒菌株的选育 取0.2～0.3cm的三种菌种的组织块分别接种到亚硒酸钠发酵培养基，装液量150mL/250mL，置于19℃、130r/min的恒温培养振荡器中震荡培养72h，测定其发酵液中残留无机硒（残硒）的含量及其生物量[5]。

1.4 富硒蛹虫草发酵液的制备 将三角锥瓶中培养的液体移入离心管中，称重后等量对称放置在台式离心机中，以4 000r/min的转速常温离心30min，离心后的上清液即为发酵液[6]。

1.5 蛹虫草生物量测定 采用干重法，将三角锥瓶中培养的液体移入离心管中，称重后等量对称放置在台式离心机中，以4 000r/min的转速常温离心30min，倾去上清液，将固体放到称量纸上，置于精密电热恒温鼓风干燥箱中，100℃烘干至恒重，称量[7]。

1.6 硒标准曲线的绘制 参加文献[8]。

1.7 发酵液中残留无机硒（残硒）含量测定 参加文献[9]。

1.8 蛹虫草耐硒实验 参加文献[10-11]。

2 结果与分析

2.1 蛹虫草富硒菌株的选育

2.1.1 硒标准曲线的绘制 以亚硒酸钠浓度为横坐标，以420nm处的吸光值为纵坐标做图，得硒标准曲线（图1），其回归线性方程为y=0.0070x-0.0050。

2.1.2 富硒菌株的选育 从表1可以看出，在指标生物量的考察中蛹虫草1占优势，在指标富硒量的考察中蛹虫草1占优势，在指标富硒率的考察中蛹虫草1同样占优势。该实验表明，在同等实验条件下蛹虫草1富硒效果最好。

2.2 蛹虫草耐硒实验 表2显示了亚硒酸钠浓度对蛹虫草菌丝体的生长情况和富硒效果的影响。由表2可以看出，培养基中亚硒酸钠浓度的高低会影响蛹虫草的生长，随着亚硒酸钠浓度的增加，生物量呈下降趋势。亚硒酸钠有一定的毒性，当亚硒酸钠浓度低于12μg/mL时，它的加入虽然会影响蛹虫草的生长，但并不显著。当亚硒酸钠浓度超过14μg/mL时，蛹虫草的生物量急剧下降，表明蛹虫草在液体发酵培养基中耐硒浓度为12μg/mL。由表2还可以看出，随着培养基浓度的增加，蛹虫草菌丝体的富硒量越高，其富硒效果越好，然而当亚硒酸钠浓度达到14μg/mL时，发酵液由淡黄色变为粉红褐色，这可能是由于蛹虫草将亚硒酸钠转化为单质硒而不是转化为有机硒的缘故。当亚硒酸钠的浓度较高时（超过14μg/mL后），尽管富硒率继续增加，但富硒量与生物量已显著下降，因此，蛹虫草1摇瓶培养时的耐亚硒酸钠最大浓度为12μg/mL，此时蛹虫草1的生物量可以达到12.01g/L，富硒量达到4.635μg/mL，富硒率达到385.92μg/g。

2.3 蛹虫草生长曲线实验 图2、3显示了蛹虫草生物量与富硒量随培养时间变化的关系。由图2、3可以看出，当蛹虫草培养72h时，生物量与富硒量均达到最高值，培养时间从12h到72h，蛹虫草的菌丝体生物量与富硒量逐渐增加，而72h之后菌丝体的生物量和富硒量急剧下降，此时菌丝体出现了明显的萎缩、老化现象，而富硒量下降的原因还有待进一步研究。

3 结论

本文研究了蛹虫草的耐硒特征，结果表明，在摇瓶培养过程中，蛹虫草耐亚硒酸钠浓度为12μg/mL时，生物量达到12.01g/L，富硒量达到4.635μg/mL，富硒率达到385.92μg/g。

参考文献

[1]于田田，王乐，钱和.蛹虫草富硒研究[J].食品研究与开发，2006，27（3）：19-21，29.

[2]张绪璋.北冬虫夏草的人工培植及其营养成分分析[J].中国食用菌，2002，22（2）：19-21.

[3]大连轻工业学院.食品分析[M].北京：中国轻工业出版社，1994.

[4]邓红.食用菌栽培与加工技术[M].北京：中国轻工业出版社，2002.

[5]朱善良.硒的生物学作用及其研究进展[J].生物学通报，2004，39（6）：6-8.

[6]罗长才.冬虫夏草深层发酵技术及其生物活性多糖的研究[D].无锡：江南大学，2002.

[7]姜明兰，钟文田.北冬虫夏草人工栽培技术研究[J].辽宁农业科学，1995（1）：54-55.

[8]尚德静，王关林.四种食用菌富硒能力的比较研究[J].食用菌学报，1999，6（3）：17-20.

[9]诸葛健，王正祥.工业微生物实验技术手册[M].北京：中国轻工业出版社，1994.

[10]邵伟，乐超银，李玲.富硒香菇菌种原生质体诱变选育[J].食用菌，2004（2）：12-13.

[11]黄渊泽，殷国健，王光灿，等.富硒食用菌中的硒含量[J].云南大学学报（自然科学版），1997，19（4）：341-343.

（责编：张宏民）