甘草中黄酮类抗氧化成分的提取工艺研究

摘要：目的探讨甘草黄酮类抗氧化成分的最佳提取工艺。方法经L9(34)正交试验研究黄酮有效部位的最佳提取工艺，对提取部位的抗氧化活性条件筛选。结果最佳工艺为：90 %乙醇提取，1∶12的加液量，加热回流3次每次1.5 h。结论本实验确定的最佳提取工艺简便可行。

关键词：甘草；黄酮；提取工艺；抗氧化活性；正交试验

中图分类号：R284.2文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)09-0025-03

Study on Extraction Technology of Antioxidative Ingredients of Flavonoids in Radix et Rhizoma Glycyrrhizae

YU Peng-fei, WANG Jian-ping, JIANG Hai-qiang, KUANG Xiao-yan, ZHONG Wei-yan, WAN Xiao-shan

(Shandong University of Traditional Chinese Medicine, 250355 Jinan, China)

Abstract：Objective To investigate the optimal extraction technology of antioxidative ingredients of flavonoids in Radix et Rhizoma Glycyrrhizae. Methods The L9（34）orthogonal experimental design was used to investigate the optimal extraction technology of flavonoids, which was followed by the screening of antioxidative activity.Results The optimal extraction condition of flavonoids in Radix et Rhizoma Glycyrrhizae was the extraction with 12 times of 90 % alcohol for 3 times by heating reflux (1.5 hour each time). Conclusion The optimal extraction technology of flavonoids in Radix et Rhizoma Glycyrrhizae obtained in this study is convenient and feasible.

Key words：Radix et Rhizoma Glycyrrhizae; flavonoids; extraction technology; antioxidative activity; orthogonal experimental design

甘草（Radix et Rhizoma Glycyrrhizae）是我国特有的中药材之一，为乌拉尔甘草、光果甘草和胀果甘草的根及根茎，隶属豆科甘草属[1]。甘草药用有效成分为甘草酸、黄酮类化合物及其它水溶性浸出物、还原糖、淀粉、氨基酸、有机酸、生物碱和多种微量元素等[2]。

甘草黄酮类成分具有明显的抗氧化作用，可预防肿瘤发生，治疗胃溃疡、肝损害，在抗炎和抗变态反应等方面也有明显的药理作用[3]。为考察甘草中总黄酮含量与抗氧化活性的关系，我们对甘草黄酮类的活性成分进行了筛选，并优化了提取工艺。

影响甘草中黄酮类成分的因素有提取方式、洗脱方式、温度、提取时间等。通过预实验，分别考察比较了超声提取、回流提取、水提取与乙醇提取等，发现最佳提取方式是回流提取，提取液的合适浓度为70 %；最佳的层析部位是60 %乙醇洗脱部位。在进一步实验中，对溶媒浓度、提取时间、加液量和提取次数进行了正交分析[4]。

1材料与仪器

甘草（购自淄博鼎立中药材有限公司，经本院周凤琴教授鉴定为豆科甘草属光果甘草）；甘草粗提物（本实验室制备）。

芦丁对照品（中国药品生物制品鉴定所，批号：0080-9705）；D101型大孔树脂；U-3010型紫外分光光度计（Hitachi High-Technologies Corporation）；FA1104型万分之一电子天平（上海天平仪器厂）；AF240型10万分之一天平（中国瑞士梅勒公司）；KQ-250型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；试剂均为分析纯。

2实验方法

2.1黄酮含量与清除自由基能力关系的考察

2.1.1标准曲线的绘制芦丁标准溶液：精确称取芦丁对照品20.00 mg，置入100 mL容量瓶，加入甲醇10 mL，水浴溶解，冷却后，加蒸馏水至刻度。精密量取对照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，分别置入25 mL容量瓶，各加水至6 mL，加5 % NaNO2 1 mL混匀，放置6 min，加入10 % Al(NO3) 3 1 mL，摇匀，放置6 min，加NaOH试液（4.3 g NaOH溶于100 mL蒸馏水）10 mL，加水至刻度，摇匀放置15 min，在510 nm处测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。各对应浓度分别为0，8.0，16.0，24.0，32.0，40.0，48.0 mg/L。

2.1.2甘草粗提物总黄酮含量的测定取甘草粗提物，精密称取样品30 mg，置入25 mL容量瓶，加甲醇溶解，用水定容。精密量取样品液10 mL ，置入25 mL容量瓶，参照2.1.1方法，配制样品液，在510 nm处测吸光度。根据标准曲线求算溶液中甘草总黄酮含量，进一步换算为甘草提取物固体中总黄酮重量百分含量（W/W）。

2.1.3清除自由基原理及甘草粗提物清除自由基效率的测定根据Fenton方法形成羟自由基模型。双氧水与亚铁离子反应形成羟自由基，自由基存活时间一般较短且有较高活性，而水杨酸能有效地捕捉羟自由基且产生有色产物，生成的产物在510 nm处有较强的吸收。因此，可经一定时间反应后，测定吸光度值（A0）。由于加入黄酮类化合物能清除羟自由基，使有色物质的浓度降低，在此条件下测定体系的吸光度值（Ax），可测定黄酮类化合物清除羟自由基的效率。

取本实验室制备的甘草粗提物，配制一系列甘草总黄酮浓度递增的样品溶液，各溶液的总黄酮含量参照2.1.2方法测定。

在25 mL比色管中依次移取0.556 g/L硫酸亚铁溶液和0.829 g/L双氧水溶液各5 mL，混合均匀后用水杨酸溶液定容至刻度。在36～37 ℃恒温水中反应15 min用分光光度计测得A0。在A0值测定体系中，分别加入配制好的系列甘草粗提物样品液1 mL，同法反应15 min后用分光光度计测得Ax。

清除效率（％）＝（A0－Ax）/ A0 ×100 %

2.1.4甘草总黄酮含量与清除自由基能力的关系分析甘草总黄酮含量与清除自由基效率之间的关系。

2.2考察影响甘草总黄酮提取的因素

2.2.1提取工艺甘草―粉碎―溶剂提取

―抽滤―浓缩―上柱―浓缩―减压干燥―粗提物

2.2.2正交试验[5] 为全面考查各因素之间的影响，设计4因素3水平正交试验，以洗脱物中总黄酮含量为指标考查提取工艺，见表1。

3结果

3.1黄酮含量与清除自由基能力的关系

3.1.1标准曲线绘制见图1。

运用最小二乘法得线性回归方程：y = 0.011 2 x+0.005 8，R2 = 0.999 8，在8.0～48.0 mg/L范围内有良好的线性关系。

3.1.2甘草粗提物的总黄酮含量总黄酮重量百分含量为40.62 %（W/W）。

3.1.3甘草粗提物清除自由基的效率见表2。

3.1.4甘草总黄酮含量与清除自由基能力的关系经分析，甘草中总黄酮的含量与其清除羟自由基的能力在16.8 %～58.42 %范围内呈量效关系：y= 1.121 9 x， R2=0.990 3。

3.2影响甘草总黄酮提取的因素

正交试验结果及分析见表3、4。

由表4可见，A、B、C、D 4因素对总黄酮得率影响的主次顺序为A>C>D>B, A因素对总黄酮的得率有显著差异，其他

因素在考察范围内影响较小。

4结果及讨论

本实验采用Fenton反应测定甘草总黄酮清除羟自由基的能力。结果证明，清除自由基能力与甘草总黄酮含量在一定范围内呈量效关系。得甘草总黄酮的最佳提取工艺为：90 %的乙醇加入12倍量，回流提取3次，每次1.5 h。按照最佳工艺所得甘草总黄酮含量为65.40 %。

对本实验方法学进一步验证表明，本实验方法的重复性较好；稳定性实验时，吸光度在40 min内RSD=3.58 %, 提示显色时间在加完显色剂15～30 min内测定为佳；精密度实验时，RSD=1.46 %，表明仪器精密度良好。本实验以芦丁为对照品，用紫外分光光度法测定甘草中总黄酮含量，操作简单且重复性好。

正交试验结果还提示，所选用乙醇浓度的3个水平之间有显著差异，乙醇浓度增高，得率增大。提取次数之间也有差异，但不是很大，提取次数增多，得率反而下降。综上所述，用90 %的乙醇加入12倍量，回流提取3次，每次1.5 h为最佳工艺。精制方法是用大孔树脂吸附层析法，60 %洗脱部位中总黄酮的含量较高。

参考文献

[1]杨云，张晶，陈玉婷. 天然药物化学成分的提取分离手册[M]. 第2版. 北京：中国中医药出版社，2003：166-167.

[2]宋小妹，唐志书. 中药化学成分提取分离与制备[M]. 北京：人民卫生出版社，2004：152-153.

[3]付玉杰，祖元刚，李春英，等. 超临界CO2萃取甘草中甘草次酸的工艺研究[J]. 中草药，2003，34（1）：31-33.

[4]刘玉红，崔红梅，陈燕，等.正交试验法研究甘草的提取工艺[J]. 中成药，2004，26（3）：239-241.

[5]周永治，马志庆.医药数理统计[M]. 第2版. 北京：科学出版社，2004：183-189.

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