濒危植物珙桐AFLP反应体系的建立及引物筛选

摘要：为研究不同生境下珙桐（Ｄａｖｉｄｉａ ｉｎｖｏｌｕｃｒａｔａ Ｂａｉｌｌ．）的遗传多样性，以珙桐叶片为材料优化建立珙桐的ＡＦＬＰ反应体系。对酶切与连接中ＤＮＡ的浓度、预扩增的引物、选择扩增中Ｍｇ２＋和ｄＮＴＰｓ的浓度进行梯度比较分析。结果显示，酶切与连接过程中ＤＮＡ的浓度变化对结果影响不大，预扩增的引物是否带有选择碱基对结果影响明显，选择扩增中ｄＮＴＰｓ浓度的变化对最终谱带影响不大，而Ｍｇ２＋浓度变化会对最终谱带产生影响，以１．７５ ｍｍｏｌ／Ｌ为宜。采用优化后的体系，从１２对Ｍｓｅ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ引物的１４４组ＡＦＬＰ选择扩增引物组合中筛选出能够得到清晰扩增谱带的７组引物组合，为今后的研究奠定了基础。

关键词：珙桐（Ｄａｖｉｄｉａ ｉｎｖｏｌｕｃｒａｔａ Ｂａｉｌｌ．）；ＡＦＬＰ；体系优化；引物筛选

中图分类号：S792.99；Q503文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）04－0831-04

珙桐（Ｄａｖｉｄｉａ ｉｎｖｏｌｕｃｒａｔａ Ｂａｉｌｌ．）为珙桐科珙桐属落叶大乔木，是我国特有的单型属孑遗植物，是国家一级保护植物［１］。珙桐天然分布在贵州、湖南、湖北、陕西、四川、云南及甘肃７省，分布范围较窄，资源量较少，仅限于一些边远山区的人迹罕至之地［２］。珙桐素有“中国活化石”之称，在植物系统发育和地史变迁上有很高的研究价值，对珙桐进行遗传多样性研究，可以为有效保护和合理利用该珍稀植物提供必要的科学依据。目前对珙桐的研究多集中在群落生物学、人工繁殖与引种栽培方面［３－８］。

ＡＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）是荷兰科学家Ｚａｂｅａｕ等［９］和Ｖｏｓ等［10］发展起来的一种检测ＤＮＡ多态性的方法，是在ＲＦＬＰ和ＲＡＰＤ基础上发展起来的，具有很多突出的优点：所需ＤＮＡ量少，不需要预知ＤＮＡ序列信息，灵敏度高；多态性丰富，分辨率高，重复性好，假阳性低，可靠性高；共显性。自问世以来，该技术在物种的品种鉴定、种质资源和遗传多样性等［１1－１3］方面的研究中被广泛应用。

本研究对影响ＡＦＬＰ扩增体系的相关因素进行了优化筛选，初步建立了适于珙桐的ＡＦＬＰ反应体系，为进一步开展该物种遗传多样性的ＡＦＬＰ分析奠定了基础。

１材料与方法

１．１材料

试验材料为神农架木鱼镇神农架部级自然保护区科研所旁与神农祭坛下功德林内移栽的珙桐，取其幼叶于冰壶中，带回实验室后置于－７０ ℃超低温冰箱保存备用。

１．２方法

１．２．１ＤＮＡ的提取方法参考邹喻苹等［１4］介绍的ＣＴＡＢ法，稍做改良后提取珙桐的总ＤＮＡ［１5］。在紫外可见分光光度计（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｕ－２８００）上，于波长２６０、２８０ ｎｍ处测定其吸光度，计算ＤＮＡ浓度；采用１％琼脂糖凝胶电泳检测，自动凝胶成像系统（ＢＩＯ－ＲＡＤ）观察拍照。

１．２．２ＡＦＬＰ试验方法

１）酶切与连接。参照Ｖｏｓ等［10］的方法，酶切与连接一步完成。２０ μＬ酶切与连接体系中包含３.00 μＬ ＤＮＡ，１２．２５μＬ ｄｄＨ２Ｏ，２．０0 μＬ １０×Ｔ４ Ｂｕｆｆｅｒ，０．３0 μＬ ＭｓｅⅠ（１０ Ｕ／μＬ），０．１５ μＬ ＥｃｏＲ Ｉ（２０ Ｕ／μＬ），１．０0 μＬ ＥｃｏＲ Ⅰ接头（５ ｐｍｏｌ／μＬ），１．０0 μＬ Ｍｓｅ Ⅰ接头（５０ ｐｍｏｌ／μＬ），０．３0 μＬ Ｔ４－ＤＮＡ连接酶（４ Ｕ／μＬ）。３７ ℃酶切与连接４ ｈ以上。其桐总ＤＮＡ作梯度稀释（２００、１００、５０、３０、１５ ｎｇ）。接头与引物序列见表１。

２）预扩增。将酶切与连接产物用ｄｄＨ２Ｏ稀释８倍作预扩增模板，在试验中对不含任何碱基和含一个选择碱基的预扩增引物（ＭｓｅⅠ－Ｃ、ＥｃｏＲⅠ－Ａ）进行筛选（表１）。２０ μＬ的预扩增体系中有３.0 μＬ模板，１０．９ μＬ ｄｄＨ２Ｏ，２．０ μＬ １０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ，１．６ μＬ ｄＮＴＰs（10 ｍｍｏｌ／Ｌ），１．２ μＬ ＭｇＣｌ２（２５ ｍｍｏｌ／Ｌ），０．６ μＬ Ｍｓｅ Ｉ引物（５０ ｎｇ／μＬ），０．６ μＬ ＥｃｏＲⅠ引物（５０ ｎｇ／μＬ），０．１μＬ Ｔａｑ酶（５ Ｕ／μＬ）。扩增程序为９４ ℃预变性２ ｍｉｎ； ９４ ℃、３０ ｓ，５６ ℃、３０ ｓ，７２ ℃、１ ｍｉｎ，３０个循环；７２ ℃延伸５ ｍｉｎ，４ ℃保存。预扩增完成后，取５ μＬ预扩增产物在０．８％琼脂糖凝胶中检测预扩增的效果，剩余产物于－２０ ℃保存备用。

３）引物筛选与选择性扩增。预扩增产物稀释１５倍后作为选择性扩增的模板ＤＮＡ，在预扩增引物的３′末端加上３个碱基作为选择性扩增引物（表１），从这１２对Ｍｓｅ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ引物的１４４个ＡＦＬＰ选择扩增引物组合中筛选适合珙桐的选择扩增引物。２０ μＬ的选择扩增体系中有５．００ μＬ模板，８．２５ μＬ ｄｄＨ２Ｏ，２．００ μＬ １０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ，１．６０ μＬ ｄＮＴＰｓ（10 ｍｍｏｌ／Ｌ），１．４０ μＬ ＭｇＣｌ２（２５ ｍｍｏｌ／Ｌ），０．８０ μＬ Ｍｓｅ Ｉ引物（５０ ｎｇ／μＬ），０．８０ μＬ ＥｃｏＲ Ｉ引物（５０ ｎｇ／μＬ），０．１５ μＬ Ｔａｑ酶（５Ｕ／μＬ）。扩增程序为９４ ℃预变性３ ｍｉｎ；９４ ℃、３０ ｓ，６５ ℃、３０ ｓ，７２ ℃、１ ｍｉｎ，退火温度每个循环递减０．７℃，共有１３个循环；９４ ℃、３０ ｓ，５６ ℃、３０ ｓ，７２ ℃、１ ｍｉｎ，３０个循环；最后７２ ℃延伸５ ｍｉｎ，４ ℃保存。

为了确定珙桐最佳的ＡＦＬＰ选择扩增条件，选用引物ＥｃｏＲⅠ－ＡＡＣ／ＭｓｅⅠ－ＣＴＴ，以３个珙桐个体的总ＤＮＡ混合液作为模板，对ＰＣＲ的影响因素Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰs作浓度梯度测试，进行单因素试验研究，各因素与水平见表２。

４）ＰＣＲ产物检测。选择扩增产物加入８ μＬ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（９８０ ｇ／Ｌ甲酰胺，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，２．５ ｇ／Ｌ 二甲苯氰，２．５ ｇ／Ｌ溴酚蓝），混合，９５ ℃变性５ ｍｉｎ后立刻转移到冰浴中冷却，避光，待用。制备６％的变性聚丙烯酰胺凝胶，预电泳３０ ｍｉｎ，恒定功率９５ Ｗ，上样扩增产物６ μＬ后继续电泳，约２ ｈ时停止电泳。采用银染方法显带，经过脱色、固定、银染、显影、定影等过程，胶板在室温下自然干燥。

２结果与分析

２．１ＤＮＡ检测结果与分析

采用改良后的ＣＴＡＢ方法提取珙桐的总ＤＮＡ，紫外可见分光光度计检测２６０、２８０ ｎｍ处的吸光度比值A２６０ ｎｍ／A２８０ ｎｍ为１．８左右。ＤＮＡ琼脂糖电泳图谱条带整齐、清晰，基本无降解，完整性好。由于ＡＦＬＰ分析对供试ＤＮＡ的要求高，所以提取高质量、高纯度的ＤＮＡ是ＡＦＬＰ分析成功的关键之一。许多研究者认为，多糖、多酚、色素等会严重影响ＤＮＡ聚合酶的活性，干扰引物与模板的结合，从而导致扩增失败。因此，在ＣＴＡＢ提取液中添加了较高浓度的ＰＶＰ４０，这样能够有效地去除多糖类、多酚类等物质的影响，提高ＤＮＡ的纯度。ＰＶＰ４０有很强的结合多酚的能力，结合后可防止酚类氧化成醌类，避免溶液变褐而具有抗氧化作用，也可防止ＤＮＡ酶降解ＤＮＡ［１4］，同时还能有效去除多糖。

２．２ＡＦＬＰ试验结果与分析

２．２．１酶切与连接Ｖｏｓ等［10］指出，多切点的酶产生小的ＤＮＡ片段，这些片段能很好地被扩增，适于在变性序列胶上分离，少切点的酶可减少被扩增的片段，而两种酶组合后ＥｃｏＲ Ⅰ／Ｍｓｅ Ⅰ产生的片段才是主要扩增的片段，故采用双酶切可以极其灵活地控制被扩增片段的大小和数目。因而，双酶切反应进行得是否完全，将直接影响试验结果。ＡＦＬＰ的前提是酶切要完全，而预扩增是检测酶切与连接效果的手段。理想的预扩增产物电泳后边缘清晰、呈纺锤形、分子量大小适当，产物片断大小为１００～１ ０００ ｂｐ适宜。

在实际操作中，酶切与连接分步操作与酶切与连接一步进行未见差别，最终选择酶切与连接一步进行的操作。酶切与连接中ＤＮＡ梯度变化结果显示ＡＦＬＰ反应对模板ＤＮＡ浓度不敏感，ＤＮＡ浓度的高低变化基本没有影响，均能得到清晰的ＡＦＬＰ图谱，取３ μＬ ＤＮＡ稀释液约３０ ｎｇ为目的ＤＮＡ进行酶切与连接，接头采用通用ＭｓｅⅠ接头、ＥｃｏＲⅠ接头（表１）。酶切与连接后的琼脂糖凝胶电泳检测如图１，结果显示弥散带为１００～１ ０００ ｂｐ，可以继续后面的试验步骤。

２．２．２预扩增预扩增中发现引物不带任何选择碱基与带一个选择碱基的预扩增终产物带型差异很大，带一个选择碱基的引物对应的预扩增终产物扩增条带数量明显减少，因此最终确定采用不带任何选择性碱基的引物作为预扩增引物。

２．２．３引物筛选与选择扩增ＰＣＲ反应中，一般认为，Ｍｇ２＋浓度不仅影响Ｔａｑ酶的活性，还能与反应液中的ｄＮＴＰs、ＤＮＡ模板及引物结合，影响引物与模板的结合效率、模板与产物的解链温度以及产物的特异性和引物二聚体的形成；ｄＮＴＰs是反应的原料，ｄＮＴＰs浓度过高，会导致ＰＣＲ错配，从而使扩增出现非特异性，浓度过低又会影响合成效率［１6］。

试验对选择扩增时的Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰs的浓度梯度优化显示，ｄＮＴＰs的浓度变化时，产物的带型及强弱差别不大，说明对于珙桐的ＡＦＬＰ选择扩增来说，ｄＮＴＰs的浓度变化对产物的影响不大，如图２所示；而Ｍｇ２＋的浓度变化有一定影响，Ｍｇ２＋的浓度较低时（１．００、１．５０ ｍｍｏｌ／Ｌ）条带较弱，条带数量也较少，随Ｍｇ２＋浓度的升高，条带强度增强，即产物产量增加，当Ｍｇ２＋浓度达到１．７５ ｍｍｏｌ／Ｌ后，带型趋于稳定，如图２。最终选择１．７５ ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｍｇ２＋及０．２０ ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰs进行ＡＦＬＰ选择扩增。

从１２对Ｍｓｅ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ引物的１４４个ＡＦＬＰ选择扩增引物组合中筛选适合珙桐的引物组合，其中７个引物组合能够得到清晰的扩增条带，其组合见表３。

２．２．４产物检测ＡＦＬＰ技术经历着由同位素标记技术、生物素标记技术、银染技术向荧光标记技术的转化。由于同位素的不安全因素，现在部分实验室采用生物素标记（如地高辛）代替同位素标记，其灵敏性略低于或相当于同位素，其优点是没有放射性，对人体不会造成伤害，但采用生物素标记流程较长，步骤比同位素标记繁琐，而且成本高。银染技术是将扩增产物经过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，用银染方法代替放射性标记进行多态性的检测。虽然银染技术比同位素标记操作安全且成本较低，对人体的伤害较小（银染过程所用的甲醛也有毒害），但流程比较长，稳定性较差，染色和显色反应受环境温度、染色和显影的时间及温度、染色液和显影液的组成等多种因素的影响，但随着操作的逐步熟练，银染能够在温度相对恒定的条件下操作，有很好的效果。本试验就是采用了银染技术。

此外，研究中发现ＡＦＬＰ标记的指纹式样会因不同厂家的Ｔａｑ酶甚至不同批次的酶而异，与明军等［１７］建立梅花基因组ＡＦＬＰ体系时的观点一致。因此，在使用某一种酶后，应立即订购同一厂家足够量的同批次酶，以保证试验的正常进行和图谱的稳定性、可比性，尽量减少误差。

３结论

尽管ＡＦＬＰ试验操作较为复杂，但由于其高效性，越来越多的研究者采用ＡＦＬＰ进行相关的遗传研究。研究通过对酶切与连接中ＤＮＡ的浓度、预扩增的引物、选择扩增中Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰs浓度的梯度比较分析，建立起适合珙桐的ＡＦＬＰ体系，为今后开展相关研究奠定了良好的基础。

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