环状定点诱变技术在单碱基定点诱变中的应用

[摘要] 目的 采用环状定点诱变技术将重组真核表达质粒pcDNA3.1-hTSHR中hTSHR cDNA序列上发生突变的单碱基诱变回正常的序列。方法 设计1对含预期突变的完全互补的诱变引物,以环状质粒为模板进行PCR扩增,得到带缺口的突变质粒,酶消化去除模板质粒,将PCR产物转化DH5α感受态细胞进行缺口修复和克隆。结果 DNA测序表明,在预期位点已成功发生诱变,且目的基因其他部位的碱基序列均未发生随机突变。结论 环状定点诱变技术是一种高效、简便、快捷的诱变方法,通过该方法成功实现了目的碱基的定点诱变,为后续研究奠定了基础。

[关键词] 环状定点突变;聚合酶链反应;质粒;人促甲状腺激素受体

[中图分类号] Q754 [文献标识码] A [文章编号] 1671-7562(2009)05-0321-04

采用体外细胞生物法来检测自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid diseases,AITD)患者体内的促甲状腺激素受体抗体(TSH receptor antibodies,TRAb)时,需要应用表达人促甲状腺激素受体(human thyroid stimulating hormone receptor,hTSHR)的细胞株。国内目前尚没有此类细胞株供应,鉴于此,本课题组尝试进行了这方面的研究,前期在构建pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达质粒时,通过DNA测序发现目的基因hTSHR cDNA序列上第256位碱基发生了突变,因此本实验拟采用环状诱变PCR法对该碱基进行诱变,以期获得序列完全正确的重组真核表达质粒。

1 材料与方法

1.1 材料

Muta-directTM定点突变试剂盒购自北京赛百盛生物工程公司,DH5α感受态细胞、DNA分子质量标准及质粒抽提纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司,pcDNA3.1-hTSHR(-256 C)重组真核表达载体为本课题组前期所构建,限制性内切酶KpnⅠ和XbaⅠ为日本TaKaRa公司产品,胰蛋白胨、酵母提取物为英国Oxoid公司产品,引物由上海生工生物工程技术有限公司合成,其余为国产分析纯。

1.2 引物设计

基本原则:上、下游引物互补,延伸方向相反,均携带突变位点,且确保突变位点在引物的中央位置;长度为25～45 bp,最好30～35 bp;退火温度不低于78 ℃;GC含量大于40%;最好使用经过纯化的引物。根据上述原则,采用Muta Primer软件得到如下引物(下划线字母为突变碱基):上游引物,5′-CTA CGT ATC TAT AGA TGT GAC TCT GCA GCA GCT GG-3′;下游引物,5′-CCA GCT GCT GCA GAG TCA CAT CTA TAG ATA CGT AG-3′。

1.3 PCR扩增反应

反应体系为50 μl,按次序加入10×反应缓冲液5 μl,质粒DNA模板2 μl(约20 ng),上、下游引物(10 pmol•μl-1)各1 μl,dNTP mix(2.5 mmol•L-1)2 μl,ddH2O 38 μl,Muta-directTM DNA聚合酶1 μl。反应条件:95 ℃预变性30 s;然后95 ℃变性30 s,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸9 min,共15个循环;最后72 ℃保温10 min。扩增反应完成后将产物冰浴5 min,然后置于室温。

1.4 模板质粒的去除

在上述PCR反应产物中加入1 μl MutazymeTM酶(10 U•μl-1)于37 ℃温育1.2 h,以除去模板质粒。该步骤的原理是MutazymeTM酶能降解甲基化或半甲基化的模板质粒DNA,而PCR扩增的新质粒DNA没有甲基化,因此不会被降解,从而净化了突变的双链DNA。

1.5 转化

将10 μl上述经酶切处理过的PCR产物加入到100 μl DH5α感受态细胞悬液中,混匀后冰浴30 min,42 ℃热休克90 s后立即冰浴2 min,加入900 μl不含抗生素的无菌LB培养液,37 ℃振荡培养45 min(150 r•min-1)。取100 μl转化后的菌液均匀涂布于含100 μg•ml-1氨苄青霉素的LB固体琼脂平板上,37 ℃培养16 h。挑取单克隆菌落并接种到5 ml含100 μg•ml-1氨苄青霉素的LB培养液中,37 ℃振荡培养16 h(250 r•min-1)。按质粒抽提试剂盒说明书提取质粒。

1.6 鉴定

将扩增后的菌液送上海生工生物工程技术有限公司,对目的基因的全部碱基序列进行测定,并采用Blast比对软件进行鉴定。用限制性内切酶KpnⅠ和XbaⅠ双酶切突变后的重组质粒,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2 结果

2.1 重组点突变质粒的酶切鉴定

克隆到pcDNA3.1中的hTSHR cDN段长度约为2.3 kb,pcDNA3.1的片段长度约为5.5 kb。所提取的突变后重组质粒经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后,在1%琼脂糖凝胶电泳上可见相应的两条特异性目的条带(图1),片段长度与预期相符,表明所挑取的单克隆菌落中的确携带有所需要的质粒,接下来通过测序进一步证明定点突变是否成功。

2.2 DNA测序结果

诱变前及诱变后目的基因的部分测序结果见图2及图3(图2中箭头所指为待诱变的碱基,图3中箭头所指为成功诱变后的碱基)。结果表明,插入到pcDNA3.1中的hTSHR cDNA序列中第259位碱基已由C突变回正常的G,即第87位氨基酸残基由亮氨酸突变回缬氨酸,而目的基因其他部位的碱基序列均未发生随机突变。

3 讨论

hTSHR是引起AITD最重要的靶抗原之一[1],TRAb是针对hTSHR所产生的一类异质性抗体。检测TRAb对于AITD的诊断、疗效的评估及预后的判断等方面具有重要的临床意义[2]。目前较为成熟的TRAb检测方法主要有受体分析法和体外细胞生物分析法[3],后者需要应用到能够稳定表达hTSHR的细胞株,鉴于国内目前尚没有此类细胞株供应,本课题组尝试进行了这方面的研究。前期在构建pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达质粒时,通过DNA测序并比对后发现所插入的目的基因片段hTSHR cDNA序列中第259位碱基由正常的G突变为C,导致第87位氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸。考虑到该位点突变可能会影响所表达的蛋白质的功能,因此需要采用定点诱变技术将突变的碱基诱变回正常的碱基。

定点诱变技术是分子生物学中常用的实验方法,通过有目的地改变DNA序列中的碱基,从而满足不同研究者的应用需求。现有的方法主要包括化学诱变、寡核苷酸介导的诱变、盒式诱变和基于PCR的诱变[4]等。其中基于PCR的定点诱变技术包括重叠延伸PCR、大引物PCR及环状诱变PCR等,这类诱变方法因其突变效率高、操作简便等优点而备受青睐,但也各有不足之处,需根据具体情况选用最适宜的方法[5]。重叠延伸PCR法应用范围非常广泛,突变成功率很高,但步骤较为繁琐,一次突变需设计2对引物,进行3次PCR反应,通常还需对中间产物进行纯化。大引物PCR法需要设计1对侧引物及1个诱变引物,进行2次PCR反应,步骤较重叠延伸PCR相对简便,但突变效率略低。而环状诱变PCR法只需设计1对含预期突变的互补的诱变引物,以环状质粒为模板进行1次PCR扩增,得到含预期突变的带缺口的环状质粒,然后用Dpn Ⅰ酶降解甲基化或半甲基化的模板质粒后,直接将PCR产物转化到感受态细胞内进行缺口修复和克隆。此方法与前两种相比更为简便快捷,无需进行亚克隆及产物纯化等繁琐的步骤,因此当待突变的基因已经克隆到环状质粒时,可优先选用环状诱变PCR法。国内已有学者采用此类方法成功实现了定点诱变[6-7]。

鉴于上述诱变方法的比较,本研究选用了环状定点诱变技术,成功实现了预期位点的单碱基定点诱变,而且在目的基因其他部位的碱基序列均未出现随机突变,从而获得了序列完全正确的pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达质粒,为后续研究奠定了基础。

环状定点诱变技术是一种高效、简便、快捷的定点诱变方法,但也存在一定的局限性,如:应用范围主要针对环状DNA,PCR扩增的产物有时会出现一些非预期突变,尤其当环状质粒长度较大时。因此该技术对DNA聚合酶的保真性、引物的设计及纯度要求很高,PCR反应的循环参数需精确调节,而且要求模板质粒绝大多数为超螺旋的。

[参考文献]

[1]Chistiakov D A.Thyroid-stimulating hormone receptor and its role in Graves’ disease[J].Mol Genet Metab,2003,80(4):377-388.

[2]兰玲,施秉银.促甲状腺素受体抗体检测的临床意义[J].国外医学内分泌学分册,2005,25(1):42-44.

[3]Cho B Y.Clinical applications of TSH receptor antibodies in thyroid diseases[J].J Korean Med Sci,2002,17:293-301.

[4]萨姆布鲁克 J,拉塞尔 D W.分子克隆实验指南[M].黄培堂,汪嘉玺,朱厚础,等译.3版.北京:科学出版社,2002:1095-1096.

[5]罗师平,冷希岗.基于PCR的体外诱变技术[J].国外医学生物医学工程分册,2005,28(3):188.

[6]刘玉冰,李晓霞,王宝利,等.一步PCR法在单碱基定点诱变中的应用[J].天津医科大学学报,2007,13(1):98-99.

[7]蔡阳林,龙跃生,石奕武,等.GEFS+致病相关基因SCN1A表达载体的定点诱变[J].广州医学院学报,2007,35(2):62-64.

[收稿日期] 2009-04-07