白僵菌菌株的ITS序列鉴定

【摘 要】球孢白僵菌是世界范围内害虫生物防治中推广和应用最为成功的昆虫病原真菌之一。我国东北地区，尤其是吉林省多年以来一直利用白僵菌进行玉米螟防治，取得良好的经济效益、生态效益和社会效益。利用分子生物学技术，通过白僵菌ITS序列快速进行种的鉴定，明确菌株的分类地位，为进一步的研究提供准确的研究材料。研究结果表明，8个白僵菌菌株都为球孢白僵菌菌株，其同源性达到99%。

【关键词】球孢白僵菌;ITS分析;分子鉴定

白僵菌属Beauveria Vuill.是全球分布的最常见的土壤虫生真菌[1]，包含有球孢白僵菌B. bassiana （Bals.-Criv.） Vuill.和布氏白僵菌B. brongniartii （Sacc.） Petch 这两种具有重要经济价值的种类。前者是森林生态系统中最为常见的一种昆虫病原真菌，属世界性分布物种，是害虫虫口自然调节的重要因子和以菌治虫的重要生物防治材料[2]。因其具有致病性强、寄主范围广、对动物植物无害、不污染环境及易培养的优点，被认为是最具开发潜力和应用价值的虫生真菌之一[3]。

随着分子生物学技术的发展，相关技术也开始广泛被应用于昆虫病原真菌的分类和鉴定中。ITS（内转录间隔区Internal Transcribed Spacer）ITS区域序列的测定是目前真菌分类研究的一项重要技术手段，对于鉴定白僵菌及研究真菌属内和属间遗传关系具有重要作用[4-8]。ITS区指的是5.8S rDNA、18S rDNA和28S rDNA之间的转录间隔区，因其进化相对迅速而具多态性与保守性，对此序列的检测有助于分析菌株的遗传关系适合较低水平的系统学研究，真菌的ITS序列长度一般在550-750bp（碱基对）。ITS序列主要被用于对不同生物型、菌株、种、属的分类鉴定，也可用于研究近或低级分类阶元的系统发育。

本文以研究室保存的8株白僵菌菌株为研究材料，通过对其ITS序列的鉴定，明确菌株的遗传背景，找出不同菌株间的遗传差异，为进一步的研究提供准确可靠的研究材料。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

随机选取8株于本实验室保存的球孢白僵菌菌株进行实验。其编号分别为Bb01-Bb08。

1.2 培养基

液体SDY培养基：蛋白胨1.0%，酵母粉1.0%，葡萄糖4.0%，pH值7.0;PDA培养基：200g土豆去皮沸水煮20min，取汁，葡萄糖2.0%，琼脂粉2.0%。

1.3 球孢白僵菌的DNA提取

挑取少量原菌，于SDY液体培养基进行活化，在26℃、180r/min的摇床中，震荡培养3-5d。从中吸取100μl菌液于PDA培养基，涂布均匀，于26℃环境培养3-5d。

参照朱衡等[9]的方法提取菌体总DNA，以0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。

1.4 ITS序列分析

选取真菌通用引物ITS1和ITS4进行本实验的ITS扩增反应，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列为：ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。以提取的基因组DNA为模板，反应体系（25μl）如下：1μl DNA模板，12.5μl 2×PCRmix，上、下游引物各0.5μl，用ddH2O补齐至25μl。PCR反应条件：94℃预变性3min;94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环;72℃最后延伸10 min;4℃保存。

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送上海生工生物工程有限公司测序。测序结果经DNAman软件进行多序列比对并建立系统同源树。

2 结果与分析

2.1 实验结果

所提取DNA均在加样孔附近呈现一致密亮带，基本无降解。所提DNA较好，可以用于扩增反应。以提取的白僵菌菌株的DNA为模板，利用上下游引物进行扩增后，对其PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图1示PCR条带与预期目的条带（600bp左右）大小吻合。

图1 ITS-PCR凝胶电泳图

2.2 ITS序列分析

利用DANMAN的多序列比对，对8个供试菌株的ITS片段进行比对拼接，经NCBI序列比对，证实这8个菌株都为球孢白僵菌菌株。

根据聚类分析构建系统同源树（图2）。结果表明8株球孢白僵菌菌株的ITS序列同源性达到99%。除Bb01、Bb08存在较小差异，其他6株球孢白僵菌的ITS序列完全一致。

图2 8株菌株球孢白僵菌株ITS序列的系统同源树

3 讨论

一些球孢白僵菌菌株在形态、生物学等方面非常相似，如何对这些菌株进行鉴定和区分，是检疫实践中面临的首要问题。随着分子生物学技术的发展，尤其是PCR技术的发展，在球孢白僵菌的分子鉴定方面发挥着越来越重要的作用。选择合适的靶序列至关重要。

核糖体DNAITS区是核糖体DNA中介于18S和28S之间的转录间隔区，包括ITS1和ITS2两段序列，它们在生物进化过程中显示种的特征，在种内具有高度保守性，在不同种间又有不同程度的变异，是最广泛应用分类鉴定的理想遗传标记。

本研究采用球孢白僵菌ITS区的通用引物扩增种群的ITS区并进行序列测定，长度分别为500bp左右。各球孢白僵菌序列长度均包含18S、28S以及5.8S基因的全部序列，通过ITS区序列比对，可以探讨菌株间在遗传上基因的距离，通过比较发现所选菌株同源性较一致。大部分同源性可达达100%。有关球孢白僵菌ITS区序列的测定以及分析，还有大量的后续工作如的进化关系、不同菌株间的鉴定方法等等需要进一步研究。通过对8株白僵菌的ITS序列鉴定，可为球孢白僵菌不同菌株间的遗传多样性积累重要的数据，同时对形态相似的菌株鉴定有积极作用。

【参考文献】

[1]Rehner SA， Buckley EP. Isolation and characterization of microsatellite loci from the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana （Ascomycota： Hypocreales） [J].Molecular Ecology Notes， 2003，3：409-411.

[2]季香云，杨长举.白僵菌的致病性与应用[J].中国生物防治，2003，19（2）：82-85.

[3]Feng MG， Poprawski T J， et al. Production of formulation （下转第248页）（上接第97页）and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control：current status[J]. Biocontrol Science and Technology，1994，4：31-34.

[4]李增智，黄勃，等.分子时代的白僵菌研究[J].菌物学报，2011，30（6）：823-835.

[5]苏宇，张泽华，等.分子标记技术在绿僵菌研究中的应用[J].中国生物防治学报，2009，25（1）：78-82.

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[9]朱衡，瞿峰.利用氯化苄提取适于分子生物学分析的真菌DNA[J].真菌学报， 1994，13（1）：34-40.