乙肝病毒X基因真核表达质粒及细胞模型的建立

摘　要：采用聚合酶链反应(PCR)方法扩增HBV X基因，定向亚克隆入真核表达载体pRc/CMV2，构建重组质粒pCMV/X；采用脂质体法转染QSC7701细胞，筛选阳性细胞克隆；RT-PCR法检测HBV X mRNA的表达情况，westem blotting法鉴定HBX蛋白的表达，结果表明，构建的真核重组表达质粒pCMV/X中包含有完整的HBV X基因片断，pCMV/X转染的QSG7701细胞中有HBV X mRNA及HBX蛋白的稳定表达，成功建立了HBV X稳定转染的细胞系，为进一步探讨HBX在HCC的发生发展过程中所起的作用，提供了一个有价值的细胞模型。

关键词：HBV X蛋白：真核表达；乙型肝炎病毒：细胞模型

中图分类号：R575.3　文献标识码：A　文章编号：1007-7847(2007)04-0355-06

乙型肝炎病毒X基因(HBV X)及其编码的多功能蛋白 (HBX)在乙肝相关的肝细胞癌(HCC)发生发展中起着重要的作用。但关于HBX能否直接转化肝细胞一直存在着争议，其原因之一可能是缺乏合适的体外模型，我们以人源性永生化非瘤性肝细胞株OSG7701为靶细胞，将HBv X导人OSC7701细胞，建立表达HBX蛋白的肝细胞模型，为探讨HBX在HBV相关HCC的发生发展过程中的作用提供一个有价值的平台。

1　材料与方法

1．1　材料

1．1．1　载体、菌株及细胞株

pGEM-T Easy Vector为美国homeCa公司产品，真核表达质粒pRc/CMV2购自Sigma公司，E.coli DH5a及人源性肝细胞株QSG7701，为本实验室保存。

1．1．2　主要试剂

Taq DNA聚合酶、10mmol/L dNTP为日本Takara公司产品：血清HBV裂解缓冲液为上海申友生物公司产品：快速连接试剂盒、限制性内切酶Apa I和HindⅢ及DNA分子量Marker均为BBI公司产品；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、无内毒素质粒小提试剂盒、TRANSfection转染试剂盒、细胞基因组DNA提取试剂盒均为北京TIANGEN生物技术公司产品；胎牛血清购自杭州赛乐生物公司：高糖DMEM为美国GIBCO公司产品：G418、蛋白分子量Marker为上海生工生物工程公司产品；Trizol为美国MRC公司产品：逆转录试剂盒为Fermentas公司产品；鼠抗人HBX单克隆抗体为德国abcam公司产品；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG、硝酸纤维素膜为ProMab公司产品：蛋白质抽提试剂盒、ECL化学发光试剂盒均为PIERCE公司产品。

1．1．3　引物

针对人HBV X基因序列的PCR引物由于akara公司合成，引物源于已发表的序列，正义5'-AAA GCTTCCA TG GCTGCTCGGGGTTG-3'：反义5'-A GGGCCCTTA GGCAGAGGTGAAAAAG-3'(正义链含有HindⅢ酶切位点和起始密码子，反义链含Apa I酶切位点和终止密码子)，目的片断大小为481bp.人β-actin，actin引物由北京鼎国生物公司合成，正义5'-TAACTGGAACGGTGAAGGTG-3'：反义5'-AGGGCACGAAGGGGCTCATCAT-3'，目的片断大小为316bp。

1．2　方法

1．2．1　HBV X基因的扩增与克隆

采乙肝患者静脉血(经湘雅医院感染病科实验室检测乙肝三项定量示：HbsAg阳性，HbeAg阳性，ttbcAb阳性)，以碱裂解法提取DNA，以此为模板，扩增HBV X基因片断，反应体系为25μL，其中含模板DNA 3μL，dNTP 1μL，上下游引物2μL，Taq DNA polymerase lμL，扩增条件为95℃5min，94℃50s，57℃50s，72℃1min，共扩增35个循环，最后72℃8min，用1.0％低熔点琼脂糖凝胶分离PCR产物，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化目的片断，与pGEM-了载体连接，连接产物命名为pGEM/X，转化感受态细菌E.coli DH5a，Amp的LB/X-gal选择性培养基筛选白色菌落，增菌后碱裂解小量抽提法提取质粒，Apa I/HindⅢ双酶切鉴定。

1．2．2真核表达质粒pCMV/X的构建及鉴定

小量提取真核表达载体pRc/CMV2及重组质粒pGEM/X，分别用Apo I和HindⅢ双酶切，X基因及质粒载体均用1.0％琼脂糖凝胶电泳、凝胶回收试剂盒回收纯化。用快速连接试剂盒进行连接，连接产物命名为pCMV/X，转化DH5a感受态细菌，挑取阳性单菌落，增菌并提取质粒，ApaI/HindⅢ双酶切鉴定，并送上海生工生物工程公司测序。

1．2．3　QSG7701细胞的培养及稳定转染

QSG7701细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基中于37℃、5％V/V C02培养箱中培养，待细胞生长至约85％的融合状态进行传代，按TRANSfection转染试剂盒提供的方法，以质粒pRc/CMV2及pCMV/X，分别转染QSG7701，实验分3组，分别为QSG7701细胞未转染组：QSG7701转染pRc/CMV2组(简称pRcCMV2/QSG)，QSG7701细胞转染重组质粒pCMV/X组(简称pCMV X/QSG)，细胞转染质粒4d后，在3组细胞的完全培养基中加入G418筛选，前2dG418浓度为200mg/L，然后将G418加量为400mg/L，共筛选2周，隔天换液，直至未转染质粒的阴性对照组全部死亡，而转染组的细胞有抗性克隆出现，以200mg/L G418维持筛选20d，然后挑取单个克隆扩大培养，建立稳定转染的细胞系，即pCMV X/QSG和pRcCMV2/QSG细胞系。

1．2．4　转染细胞中目的基因DNA的鉴定

用细胞基因组DNA提取试剂盒提取转染细胞中的基因DNA，PCR法扩增鉴定HBV X基因。

1．2．5　转染细胞的总RNA的提取及PT-PCR鉴定

采用Trizol试剂提取转染细胞中的总RNA。通过RT-PCR扩增HBV X mRNA基因。

1．2．6 表达产物的Western blottin~鉴定

在冰上按蛋白提取试剂盒操作步骤提取细胞蛋白质，加入适量2XSDS凝胶加样缓冲液(50mmol/L Tris HCl，pH 6.8；100mmol/L DTT：2％SDS；0.1％溴酚蓝；10％甘油)，100℃煮沸3min，使蛋白质变性，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至硝酸纤维素膜上，硝酸纤维素膜在5％脱脂牛奶(5g脱脂牛奶+100mL PBS)中室温封闭1h，分别加入特异性HBX抗体(1:50)和

GAPDH抗体(1:2000)，37℃水平摇床孵育1h，4℃过夜，PBS充分洗涤后分别加入辣根过氧化物酶标记的相应的二抗。即猴抗羊IgG(1:1000)和羊抗鼠IgG(1:1000)，37℃水平摇床孵育2h，充分洗涤后，化学发光试剂(ECL)A液和B液混合后加至硝酸纤维素膜上，暗示曝光3～5min，取出X光片，显影，定影观察结果。

2　结果与分析

2．1　PCR扩增血清中I-IBV X基因片断

以HBV感染者的血清DNA为模板，扩增出HBV X基因片段，琼脂糖凝胶电泳，目的条带出现在500bp左右的位置，与预计的481bp相符，阴性对照组是以正常人血清中提取的DNA为模板，未扩增出目的片断，见图1表明通过PCR方法已从HBV感染者血清中成功扩增出HBV X基因片段，为下一步基因克隆打下了基础。

2．2　重组质粒pGEM/X阳性克隆的筛选及鉴定

PCR产物与pGEM-T载体连接，转化感受态细菌，挑选白色菌落，增菌提取质粒，质粒经Apa I/HindⅢ双酶切，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳，于500bp左右可见一清晰的条带，与预计的481bp相符，表明经PCR扩增的X基因片段已成功克隆人pGEM-T载体中，见图2。

2．3　重组表达质粒pCMV/X的筛选及鉴定

重组表达质粒pCMV/X经Apa I/HindⅢ双酶切后，酶切产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，可见大小两条清晰的条带，小分子条带位于500bp左右，与HBV X基因的大小相符，表明重组表达质粒pCMV/X的构建是成功的，见图3。

2．4　重组表达质粒pCMV/X测序鉴定

重组表达质粒pCMV/X测序报告所示目的片段序列与GenBank上AYl230 HBV X基因序列一致，测序引物为T7，从第10位至478位碱基为目的片段，见图4，上述结果进一步证实已成功构建了重组表达质粒pCMV/X。

2．5　G418筛选转染细胞及克隆形成

质粒pCMV/X和pRc/CMV2分别转染QSG7701细胞后，经G418筛选2周后。作为阴性对照的未转染的QSG7701细胞全部死亡，转染细胞组有抗性细胞克隆出现，分别获得pCMV X/QSG细胞阳性克隆8个，pRcCMV2/QSG细胞阳性克隆6个，转染后的细胞在倒置显微镜下观察细胞形态与正常QSG7701细胞相比无明显变化，仍表现出上皮样细胞的特点，为扁平的多角形细胞，见图5.200 mg/L G418维持筛选的过程中，发现细胞克隆逐渐增多，增大，肉眼观察可见白色的细胞克隆，pCMV X/QSG组共25个，pRcCMV2/QSG组共19个，上述结果表明。重组表达质粒pCMV/X及质粒pRc/CMV2已分别稳定转染QSG7701细胞，并已分别获得相应细胞克隆。

2．6　转染细胞中HBV X基因鉴定

pCMV X/QSG细胞DNA经PCR扩增后，在500 bp下方出现一特异性条带，与预期片段大小481 bp一致，电泳条带清晰，无杂带，无拖尾，而pRcCMV2/QSG及未转染质粒的QSG7701细胞DNA经PCR扩增后均未见特异性片段，见图6，结果表明重组质粒pCMV X转染的QSG7701细胞中包含目的基因片段HBV X。

2．7　RT-PCR检测转染细胞中HBV X mRNA的表达

从3种细胞中提取细胞总RNA，分别进行RT-PCR扩增反应，结果显示pCMV X/QSG组在500 bp附近出现清晰的条带，与预期的481 bp吻合。而pRcCMV2/QSG及QSG7701组无目的条带出现，表明在pCMV X/QSG细胞中存在HBVX转录产物的表达，见图7，结果表明重组质粒pCMV X转染的QSG7701细胞能特异性地表达HBV X mRNA。

2．8　Western Blotting检测转染细胞中HBX的表达

pRcX/QSG细胞提取蛋白在分子质量约17kD处可检测到特异性蛋白条带，与HBVX蛋白的理论分子质量是一致的。而pRcCMV2/QSG及未转染质粒的QSG7701细胞抽提蛋白则未见HBV X蛋白表达，见图8，结果表明重组质粒pCMV X转染的QSG7701细胞能特异性地表达HBV X蛋白。

3　讨论

在HBV编码的蛋白质中，HBX是一种由154个氨基酸残基组成的多功能蛋白，大量研究表明，即使HBX对HBV的感染不是绝对必须的，它也至少在HBV的复制中起着关键的作用，因而HBX与HBV的生命周期、致病机制甚至HCC的发生发展密切相关，HBX具有广泛的反式激活功能，它虽然不能与DNA直接接合，但可以通过蛋白，蛋白相互作用，激活多种信号传导通路(如FasL/Fas、JAK/STAT、Ras/Raf和JNK传导通路等)，来调节各种信号蛋白及原癌基因的表达，而这些蛋白常参与细胞增殖、有丝分裂、分化及恶性转化等生理病理过程，HBX长期缓慢激活信号传导途径，类似于弱的肿瘤促进剂，这已成为HBX致癌的热点机制。

目前，关于HBX在HBV感染及HCC发生发展中所起的确切作用仍存在很大争议，许多研究结果甚至相互矛盾，在HBX漫长的致癌过程中，有许多因素在不同阶段参与作用，全面研究HBX生物学特性，将有助于揭示HBV相关HCC的发生和发展机制，为了进一步探讨HBX在HCC发生过程中所起的作用及其确切的分子机制，建立恰当的细胞、动物模型是至关重要的，然而，在转基因的肝细胞模型中，大多是以人或鼠肝癌细胞如HepG2、HepG2.2.15、QGY7701、Huh7等为研究对象，来探讨HBX在肝癌细胞的凋亡、分化与增殖中的信号传导通路，以及细胞癌基因的激活等方面所起的作用，而对HBV X基因及HBX蛋白对非瘤性肝细胞的影响研究甚少，HBX能否转化正常肝细胞甚至瘤性转化正常肝细胞?目前在这方面的报导极少。

因此，本研究选用了人源性非瘤性肝细胞QSG7701为研究对象。将含全长HBV X基因的真核重组表达质粒pCMV/X转染QSG7701细胞，建立HBV X稳定转染的肝细胞模型，以探讨HBX对正常人肝细胞的转化作用，首先，HBV X真核表达质粒构建的成功与否，关系到细胞模型中HBX的表达，直接影响到实验的结果，也是目前关于HBX的研究结果出现分歧的原因之一，本实验中。我们选用的真核表达载体为pRc/CMV2，在其强大的启动子SV40和CMV的作用下，HBV X基因在转染细胞中实现了高水平的转录和表达，为建立理想的细胞模型打下了基础。

在扩增HBV感染者血清中HBV X基因的引物设计及选择方面，我们考虑到HBV共有8种基因型(A-H)，基因型的差异可以引起HBX氨基酸的差异。而这些差异可导致HBX反式激活功能的不同，至于是否会导致不同的临床及病理表现，目前还不确定，亚洲地区HBV主要基因型为B型和C型，而中国人以adr亚型为主，故我们扩增HBV X的引物设计是针对adr亚型HBV X的基因序列，并成功地从“大三阳”且HBV DNA阳性患者的血清中扩增出目的HBV X片段，真核重组表达质粒pCMV/X测序目的基因，其结果与PubmedGenBank中adr亚型的HBV又序列吻合。

在HBV感染的哺乳动物中，宿主基因组DNA中常有一个或多个位点上整合有HBVDNA，这种整合可影响到癌基因或(和)抑癌基因的表达，在HCC的发生中起着一定作用，而在HBV的4个开放阅读框中，X基因是最容易整合的序列，可以部分或全部整合至宿主DNA中，在转染了HBV X的细胞中，外源基因是否整合至宿主DNA是随机的，这正好模拟了人类HBV感染后，HBV X基因的整合，在本研究中，经HBVX转染的阳性细胞克隆经PCR，RT-PCR和West，ern Blotting证实， 目的基因HBV X已导人QSG7701细胞中，并有转录产物及蛋白的表达，说明HBV X是全部整合至细胞基因组DNA中，获得了可稳定表达HBX的肝细胞株pCMV X/QSG，为下一步体外研究HBX对正常人肝细胞的转化作用，及体内研究HBX的致瘤性打搭建了一个好的平台。基于这个平台，我们可以从多方面研究HBX在HBV感染和诱发HCC中的作用。

作者简介：李涛(1986―)，女，湖南湘乡人，硕士研究生，主要从事乙型肝炎相关研究，现在上海市公共卫生临床中心重症肝病ICU病房工作；刘国珍(1963―)，男，湖南宁乡人，教授，医学博士，通讯作者，主要从病毒性肝炎基础与临床研究，曾在美国贝勒医学院从事相关研究工作近3年。