过氧化苯甲酰和微波对3种食用菌杂菌的灭菌效果

摘 要：以在食用菌培养基中最常见的3种菌（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉菌）作为消毒灭菌试验对象，用过氧化苯甲酰和微波及二者联合进行消毒灭菌效果试验，以检测其消毒灭菌效果。试验结果表明，随着微波时间的增加，菌的数量逐渐减少，微波时间为120 s时大肠杆菌全部被杀死，160 s时黑曲霉全部被杀死，180 s时枯草芽孢杆菌全部被杀死；随着过氧化苯甲酰浓度的升高，3种菌的数量均在减少，大肠杆菌与黑霉菌在浓度为10 000 mg/L时全部被杀死，枯草芽孢杆菌在浓度为20 000 mg/L时全部被杀死；在微波与过氧化苯甲酰共同作用试验中选用最难杀灭的枯草芽孢杆菌作为试验菌种，在过氧化苯甲酰浓度为1 000 mg/L、微波90 s时全部被杀死。

关键词：食用菌；微波时间；过氧化苯甲酰；消毒灭菌

中图分类号：S646 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2014）04-0063-04

随着消毒学的发展，消毒方法日益增多，一般分为物理法、化学法与生物法三大类。目前在我国使用较多的物理法有加热、过滤和各种辐射处理等；化学消毒法是利用化学药物杀灭病原微生物；生物消毒法是利用一些生物来杀灭或去除病原微生物，其作用缓慢、效果有限。微波消毒灭菌是近年来发展较快的一项新技术，已在食品工业和医药卫生领域的某些方面推广应用。本试验测定了微波不同作用时间下，食用菌3种常见杂菌的灭菌效率，并且与传统的高压蒸汽灭菌效果进行比较。在一般生产中，与目前的蒸汽灭菌方法相比，高温蒸汽灭菌[1]更节能、更快捷、更方便、更容易操作和控制[2～6]。

过氧化苯甲酰（Benzoyl Peroxide，BPO）为一种食品添加剂，主要用来使小麦粉增白，俗称面粉增白剂。过氧化苯甲酰可释放出原子态活性氧，破坏微生物新陈代谢相关酶的功能，使杂菌无法生存，因其具有杀菌防虫作用，故有利于面粉保管和储存[7]。本次试验主要采用过氧化苯甲酰作为灭菌的消毒剂，观测过氧化苯甲酰的灭菌效率，并将其与微波灭菌的效率比较，以探索最佳的灭菌浓度，寻求最优的灭菌方法。

1 材料与方法

1.1 菌种培养

①大肠杆菌的培养 取冻存的大肠杆菌涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，37℃培养24～48 h，挑取光滑的砖红色菌落接种至牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃振荡培养18 h备用。

②黑曲霉菌的培养 取冻存的木霉菌涂布于马铃薯葡萄糖平板上，37℃培养24～48 h，挑取活性菌落接种至马铃薯葡萄糖培养液中，37℃振荡培养18 h备用。

③枯草芽孢杆菌的培养 取冻存的枯草芽孢杆菌涂布于LB培养平板上，37℃培养24～48 h，挑取活性菌落接种至LB培养液中，37℃振荡培养

18 h备用。

1.2 微波炉灭菌试验

每种液体培养基用500 mL，每种固体培养基用2 000 mL。

①菌原液数量测定 取3种菌液5 mL分置于3支试管中，静置10 min后用稀释平板计数法计数，方法如下。

a.编号。取无菌培养皿分别用记号标明10-4、10-5、10-6各3套。另取6支盛有无菌水的试管，排于试管架上，依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。

b.倒平板。将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基融化后冷却至45°C左右倒入无菌平板，凝固后，倒置于37℃恒温箱中放置24 h，使其干燥备用。

c.稀释。用1 mL无菌吸管精确地吸取1 mL菌体悬液放入10-1的试管中，吸吹3次使其均匀，依次配制浓度10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的菌液。

d.取样。用3支0.2 mL的无菌吸管分别从10-4、10-5、10-6的稀释液取0.2 mL菌液，对号放入无菌平皿中。

e.涂布。用3支0.2 mL的无菌吸管分别从10-4、10-5、10-6的稀释液中吸取0.2 mL菌液，再用无菌玻璃刮棒将菌液在平板上涂布均匀，放在实验台上20～30 min，使菌液渗透于培养基 37℃倒置培养

24 h。

f.计数。培养24 h的平板进行计数，算出同一稀释度3个平板上的菌落平均数，每1 mL活菌总数=同一稀释度3次重复的菌落平均数×稀释倍数×5。

②取菌液 3种菌液中各取5 mL，分装于10支试管中。

③密封 注意3种不同菌试管各用一种，保证每次作用强度一样。微波炉小火强度分别作用各管20，40，60，80，100，120，140，160，180，200 s。灭菌完成后放置10 min，采用稀释平板计数法计数。

④重复以上步骤3次 放到培养箱中培养

24 h以后，照相并且记录数据。

1.3 过氧化苯甲酰消毒效果试验

①菌原液细菌数量测定 取菌液5 mL入试管，静置10 min 摇匀后，用无菌吸管吸1 mL入试管，用稀释平板计数法计数。

②消毒液作用 a.消毒液制备。称取过氧化苯甲酰5，25，50，500，5 000，10 000 mg在500 mL容量瓶中分别配制10.0，50.0，100.0，1 000.0，10 000.0，

20 000.0 mg/L过氧化苯甲酰溶液。

b.从培养的3种菌液中各取5 mL分装于6支试管中。

c.分别取10.0，50.0，100.0，1 000.0，10 000.0，

20 000.0 mg/L 6种浓度的过氧化苯甲酰对试管中的菌液进行灭菌，作用10 min。

d.采用平板计数法计数。

e.重复以上步骤3次。

将平板放到培养箱中培养24 h以后，取出照相并且记录数据。

1.4 微波与氧化剂共同作用试验

根据微波灭菌和过氧化苯甲酰灭菌试验结果，选择2种处理下都比较难灭的枯草芽孢杆菌对其进行共同作用试验，并且观察试验结果。

原菌液计数，取菌液5 mL入试管，静置10 min 摇匀，用无菌吸管吸1 mL入试管，用稀释平板计数法计数（方法如上）。

①消毒液处理 取菌液5 mL入试管分别编号，分别加入10.0，50.0，100.0，1 000.0，10 000.0， 20 000.0 mg/L 6种浓度的过氧化苯甲酰对试管中的菌液进行灭菌，作用10 min（使用四氯化碳作为溶剂）。

②微波炉处理 密封后，放入微波炉中分别作用30，60，90，120，180 s，然后取出在无菌工作台上用稀释平板计数法计数。

将平板放到培养箱中培养24 h，第二天取出照相并记录数据。

2 结果与分析

2.1 微波作用对3种菌种的杀菌效果

试验结果（表1）显示，微波20 s后大肠杆菌还剩（4.5±0.2）×109，黑曲霉菌还剩（2.9±0.1）×108，枯草芽孢杆菌还剩（5.5±0.3）×107；微波40 s后大肠杆菌还剩（4.6±0.3）×108，黑曲霉菌还剩（9.5±0.2）×107，枯草芽孢杆菌还剩（2.6±0.1）×107；微波60 s后大肠杆菌还剩（7.2±0.5）×106，黑曲霉菌还剩（3.8±0.4）×107个，枯草芽孢杆菌还剩（4.8±0.2）×106；微波80 s后大肠杆菌还剩（5.7±0.2）×106，黑曲霉菌还剩（1.8±0.4）×107个，枯草芽孢杆菌还剩（3.3±0.3）×106。

在微波炉灭菌的试验中，随着微波时间的增加，菌的数量逐渐减少。微波时间为120 s时，大肠杆菌全部被杀死，160 s时黑曲霉菌全部被杀死，180 s时枯草芽孢杆菌全部被杀死，达到了彻底灭菌的效果。微波可使物质中偶极子（如水分子）产生高频运动，从而将存在的微生物杀灭。由于该法兼有热和其他效应，故其杀菌作用与红外线加热方法相比，具有作用温度低、所需时间短等优点。

2.2 不同浓度过氧化苯甲酰对枯草芽孢杆菌的杀菌效果

表2结果表明，过氧化苯甲酰浓度为10 mg/L时，大肠杆菌还剩（1.2±0.2）×108，黑曲霉菌还剩（2.1±0.3）×107，枯草芽孢杆菌还剩（5.0±0.1）×108；浓度为50 mg/L时，大肠杆菌还剩（4.0±0.2）×107，黑曲霉菌还剩（5.6±0.4）×106，枯草芽孢杆菌还剩（1.3±0.3）×108；浓度为100 mg/L时，大肠杆菌还剩（6.5±0.3）×106，黑曲霉菌还剩（3.3±0.2）×106，枯草芽孢杆菌还剩（5.4±0.2）×107。

试验结果显示，随着过氧化苯甲酰浓度的升高，3种菌的数量均减少。大肠杆菌与黑曲霉菌在浓度为10 000 mg/L时全部被杀死，枯草芽孢杆菌在浓度为20 000 mg/L时全部被杀死，同样达到了彻底灭菌的效果。

2.3 过氧化苯甲酰和微波共同作用对3种菌种的杀菌效果

在微波与过氧化苯甲酰共同作用试验中选用最难杀灭的枯草芽孢杆菌作为试验菌种，试验结果（表3）表明，当过氧化苯甲酰浓度为1 000 mg/L、微波90 s时枯草芽孢杆菌全部杀灭，达到了彻底灭菌的效果。相比于上述单一的灭菌方法，二者共同作用下明显提高了灭菌效率。

3 结论与讨论

食用菌培养料消毒灭菌大多采用加热蒸汽灭菌方法，虽然消毒灭菌效果彻底，但费工、费时、成本高。王卫国等[8]研究表明，用一定功率的微波加热食用菌栽培料袋时，菌袋内物料的增温与加热时间成正比，与物料质量成反比；在 0.15 MPa微波加热加压维持15 min 与高压蒸汽维持1.5 h 的灭菌效果相当；两种灭菌方法对食用菌料袋栽培金针菇没有明显差别。本试验中采取微波灭菌的方法，大肠杆菌与黑曲霉菌在2～3 min完全被杀灭，枯草芽孢杆菌则在3 min能全部被杀灭。在实际测试中，微波3 min时温度大概能达到95℃，而在相对较低的温度下一样能杀灭细菌。所以关于微波杀菌的机理，除了热效应外，还可能有非热效应，尚需进一步研究。

通过过氧化苯甲酰灭菌试验发现，相比微波灭菌，过氧化苯甲酰的灭菌效率要高，然而其成本相对较高。本试验采用微波炉与过氧化苯甲酰2种方式开展灭菌消毒试验，通过对试验结果进行分析表明，微波消毒后废物无毒性、无残留物、损坏轻，且微波消毒所需工作环境与占地面积小，对周围环境不致形成高温，清洁、卫生，而氧化剂灭菌相较于高压蒸汽灭菌更加高效，但是成本却相对较高。

参考文献

[1] 蔡爱群.浅谈影响食用菌固体培养基灭菌的因素[J].中国食用菌，1999，17（6）：6-7.

[2] 骆琳，丁青芝，张勇.微波灭菌在食品工业中应用研究现状[J].江苏调味副食品，2008，25（3）：22-29.

[3] 徐怀德，王云阳.食品杀菌新技术[M].北京：科学文献出版社，2005：205-218.

[4] 葛新锋，刘存祥.微波对固体培养物料的灭菌工艺的试验研究[J].河南农业大学学报，2007，41（3）：322-325.

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[6] 颜志红.超声微波连续逆流提取、微波灭菌、真空带式干燥技术及设备的特点[J].中国制药装备，2010（3）：18-23.

[7] 杨其林，李俊超，陈海峰，等.面粉改良剂应用问题及对策[J].粮食与油脂，2007（11）：33-35.

[8] 王卫国，李玉薇，王芳，等.食用菌栽培袋的微波灭菌研究[J].食用菌，2011（2）：60-63.