过氧化氢对原代人结肠上皮细胞谷氧还蛋白表达的影响

【摘要】目的采用体外研究方法,探讨过氧化氢(H2O2)对原代人结肠上皮细胞谷氧还蛋白(Grx)表达的影响。方法体外分离培养原代人结肠上皮细胞;通过相同浓度H2O2或不同H2O2浓度刺激原代人结肠上皮细胞,使细胞处于氧化应激状态,应用MTT比色法检测不同浓度的H2O2对细胞活力的影响,半定量RTPCR检测H2O2对细胞Grx基因表达的影响。结果400μmol/L以上的H2O2降低细胞活力;300μmol/浓度的H2O2在一定时间内,随刺激时间的延长,Grx基因表达相应增加(P

【关键词】过氧化氢;谷氧还蛋白;氧化应激;原代人结肠上皮细胞

结肠癌是威胁人类健康的最常见肿瘤之一,目前为止其发生和发展机制尚未完全阐明。已有研究表明,过氧化氢(H2O2)等活性氧引起的氧化应激在结肠癌的发生发展中起着重要作用,而谷氧还蛋白(Grx)参与了细胞内氧化还原状态的维持,且可能在细胞内氧化还原状态的调控以及抵抗氧化应激过程发挥重要作用。但H2O2引起的氧化应激是否对人结肠上皮细胞Grx产生影响至今未见报道。所以本实验以原代培养的人结肠上皮细胞为研究对象,观察氧化应激是否可引起细胞Grx的高表达,试图为探讨结肠癌的发病机制和治疗提供一定的理论依据。

1材料与方法

1.1原代人结肠上皮细胞的培养参照文献的方法培养人原代结肠上皮细胞。具体方法如下:取本院病理证实的结肠癌患者,术前征得患者同意,手术中取距肿瘤至少10cm的正常结肠组织,立即用DHanks液冲洗干净,剪成1cm2的小块,剪碎,转入含50mlDHanks离心管中室温下800g离心15min,把沉淀转入100ml的烧杯中。

加入25mg/L的嗜热菌蛋白酶消化液50ml(购自美国Sigma公司),37℃震荡40min,800g离心5min;将沉淀转入20mlⅠ型胶原酶(北京鼎国公司),37℃震荡40min,1000g离心10min;用DHanks液将沉淀反复吹打10min,400μm分样筛滤过后收集过滤液,再用80μm的分样筛滤过,反转分样筛后,用DHanks反复冲洗,收集冲洗液,1000g离心5min,将细胞沉淀悬浮于含10%胎牛血清(杭州四季清)的DMEM完全培养基中,种植在25cm2的培养瓶中,37℃,5%二氧化碳孵箱内培养90min后,把培养液连同未贴壁的细胞转入新培养瓶中,每48h更换培养液1次,约15d汇合成片。按常规培养细胞方法传代,在第一次传代的前3d加入0.05g/LⅠ型胶原酶,继续培养,当细胞传至5~7代时作为实验的研究对象用。

1.2四唑盐(methyltetrazolium,MTT)比色法检测细胞活力将原代人结肠上皮细胞分成6组,各组设5个重复样品,分别为:正常对照组(未加任何处理因素)、100μmol/LH2O2、200μmol/LH2O2、300μmol/LH2O2、400μmol/LH2O2、500μmol/LH2O2组,以每孔103个细胞的密度接种于96孔培养板中,待细胞完全汇合后,换成无血清DEMN培养基。按上述分组处理细胞,继续培养60min后,每孔加入浓度为5mg/ml的MTT20μl,37℃、5%二氧化碳培养箱内孵育4h,弃培养液,加入150μlDMSO振荡仪振荡10min,至晶体颗粒溶解,在酶标仪上测定490nm的吸光度值(A值)。

1.3半定量RTPCR扩增Grx和βactin基因时间相关性研究中,将原代人结肠上皮细胞如下分组:第1、2、3、4、5正常对照处理时间分别为0、10、20、30、60min组,第6、7、8、9、10分别为300μmol/LH2O2作用0、10、20、30、60min组。剂量相关性研究分组:第1组为正常对照组(0μmol/LH2O2),第2、3、4、5、6组分别为100μmol/LH2O2、200μmol/LH2O2、300μmol/LH2O2、400μmol/LH2O2、500μmol/LH2O2,刺激时间30min。细胞传至6孔板,完全汇合后,换成无血清培养基,按上述分组处理,继续培养后,收集细胞,参照Trizol试剂盒(日本Takara产品)说明书提取细胞总RNA,以紫外分光光度计检测其浓度和纯度,A260/A280比值在1.7~19之间,提取后予低温冰箱保存以备扩增Grx和βactin基因用。

Grx引物序列为:上游引物5'GCATGGCTCAAGAGTTTGTG3',下游引物为:5'CCACCAGAAGTGCTGTCATCATT3,扩增片段长度400bp,内参βactin上下游引物分别是5'GTGGACATCCGCAAAGAC3'以及5'GAAAGGGTGTAACGCAACT3',βactin扩增的产物300bp。应用Takara公司的一步法试剂盒扩增Grx和Bactin基因,扩增时取0.8μg的总RNA和0.4pmo/μl的Grx和βactin上下游引物分管扩增,扩增条件:逆转录为50℃45min,变性为94℃30s,退火为57.2℃60s,延伸72℃60s,30个循环,产物取5μl于1.8%琼脂糖凝胶电泳,DOCGEL2000凝胶成像系统分析。

1.4统计学方法采用SPSS11.5统计软件处理,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,不同组间用OneWayANOVA进行单变量方差分析,多重比较采用LSD法。

2结果

2.1原代人结肠上皮细胞的形态观察光镜下原代培养的人结肠上皮细胞单层生长,互不重叠,多呈扁多角状、椭圆状、短梭状,核仁1~2个,胞质丰富,边界清楚,紧贴培养瓶,透光性好(见图1)。

2.2不同浓度的H2O2对细胞活力的影响细胞活力=(加H2O2A值不加细胞A值)/(对照组A值不加细胞A值)×100%表示。100μmol/ml、200μmol/ml、300μmol/mlH2O2对结肠上皮细胞活力没有明显影响(P>0.05),而400μmol/ml、500μmol/mlH2O2则降低细胞活力(P

2.3H2O2对细胞Grx基因表达的影响用计算机扫描分析条带光密度,根据目的基因与内参蛋白条带光密度值比计算GrxmRNA的相对表达量,以代表其基因表达水平。因300μmol/L以下的H2O2对细胞活力无明显影响,故在观察不同时间对人结肠上皮细胞的Grx基因表达水平时选择此浓度。未加处理因素的对照在各时间组Grx基因表达无统计学差异(P>0.05),而H2O2在一定时间内,随时间的延长,Grx基因表达相应增加(P

各浓度H2O2均表达Grx基因,在300μmol/L以下,随着H2O2浓度的增加,Grx基因表达水平亦相应增加(P0.05),而500μmol/L浓度的H2O2组Grx基因表达与400μmol/L组相比有所下降(P

图1原代人结肠上皮细胞(光学显微镜×400)

图2MTT所测的不同浓度的H2O2对人结肠上皮细胞活力影响

1为正常对照组,2、3、4、5、6分别为100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L、400μmol/L、500μmol/LH2O2组,x±s,n=5,*P

图3300μmol/LH2O2刺激不同时间对人结肠上皮细胞Grx基因表达的影响

M:Marker,AE:0、10、20、30、60min对照处理组,FJ:0、10、20、30、60minH2O2处理组。

图4300μmol/LH2O2刺激不同时间对人结肠上皮细胞Grx基因表达的影响。x±s,n=6,*P

图5不同浓度H2O2对人结肠上皮细胞Grx基因表达的影响

M:Marker,AF:0、100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L、400μmol/L、500μmol/LH2O2组.

图6不同浓度H2O2对人结肠上皮细胞Grx基因表达的影响

1、2、3、4、5、6分别为0μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L、400μmol/L、500μmol/LH2O2组,x±s,n=6,*P

3讨论

结肠腔存在大量的肠道微生物以及食物代谢产物及包括氧气在内多种气体,这种环境使活性氧(Reactiveoxygenspices,ROS)容易生成,特别在高脂肪、高蛋白饮食条件下生成更多,最终可使肠上皮细胞受到损害。活性氧是一种普遍存在的含氧活性分子,正常情况下,在体内与机体的抗氧化机制维持平衡,病理状态下,如ROS数量升高或抗氧化机制失常,就会导致体内微环境处于氧化应激状态,使体内细胞异常增生或凋亡减少,进而导致肿瘤的发生、发展[3]。在体内ROS的主要形式是H2O2,作为活性氧的一种重要形式,由于与炎性反应、纤维化和肿瘤发生、发展关系密切而被广泛研究。也有研究表明活性氧水平在大肠恶性肿瘤组织中增高,且近年的研究发现,H2O2还可作为一种特殊的信号分子,参与诸如细胞凋亡、细胞增殖等许多重要细胞功能[3]。已经有研究表明,外源性或内源性H2O2能够激活细胞丝裂原活化蛋白激酶mitogenactivatedproteinkinaseMAPK)MAPK,增加cjun、ERK、cfos、cmyc等相关基因的表达,并能够激活转录因子NFkB及AP1[7],导致细胞异常分裂、增生、肿瘤形成,所以本实验使用外源性H2O2来模拟大肠腔内的氧化应激环境来刺激原代人结肠上皮细胞和检测实验指标。

Grx又称巯基转移酶,是巯基二硫键氧化还原酶家族的重要组分,广泛存在于原核、真核生物中,是机体内能特异还原谷胱甘肽化蛋白质的一种酶蛋白。研究发现,在各种氧化应激损伤过程中,PrSSG最先形成,是细胞内氧化调节的关键事件,而Grx的作用主要是对蛋白质S(早期氧化损伤形成的PrSSG进行修复[8],在体内的抗氧化防御体系中,Grx发挥着关键作用。Grx又是一种多功能蛋白,还参与生命过程中的许多环节,如参与DNA的生物合成、具有脱氢抗坏血酸还原酶活性、在信号转导和转录因子等方面起作用[9]。目前认为Grx也是细胞内一种重要的抗凋亡因子,在调节细胞生长和凋亡的多条信号通路中发挥作用,Lee等[10]已经证明,Grx能与细胞凋亡的信号调控激酶1(apoptosissingnalregulatingkinase1,ASK1)结合,抑制ASK1的活性,从而导致凋亡的减少。总之Grx系统具有更好的维持细胞内还原环境的能力,另外,Grx系统对活性氧导致的细胞氧化应激损伤有阻抗和治疗作用,所以越来越受到人们的关注。研究发现,H2O2可诱导体外培养的人晶状体细胞和人冠状动脉平滑肌细胞Grx基因表达的的增加,但H2O2引起的氧化应激是否可诱导结肠上皮细胞Grx表达增加还未有报道,故笔者用体外研究模型,观察H2O2对人结肠上皮细胞Grx基因表达的影响。

本实验结果显示,原代培养的人结肠上皮细胞在不影响细胞活力的情况下,H2O2刺激对Grx基因表达在30min之内呈时间依赖性,在刺激30min时,Grx基因表达量达最大水平,随后随着刺激时间的延长,Grx基因表达并未相应增加,所以在观察不同浓度的H2O2对Grx基因表达时选择刺激30min后检测。结果显示,在300μmol/L浓度以下,H2O2对Grx基因表达有浓度依赖型,而在400μmol/L浓度时Grx基因表达并未相应增加,在500μmol/L与400μmol/L相比有所下降,但仍较对照明显增加,这可能与500μmol/L浓度时明显损伤细胞,导致有活力的细胞减少,从而部分抵消了其引起的Grx基因表达增加。H2O2诱导Grx基因表达增加,可能与氧化应激反馈性的上调形成机体的抗氧化反应有关,氧化应激的适应性或保护性反应,在一定程度上可同时启动体内的自我保护性调节机制上调抗氧化物质的表达。Grx表达增加可通过特异性催PrSSG的还原来保护蛋白质免受应激的损伤,也可通过恢复细胞一些含有半胱氨酸残基的抗氧化蛋白和转录因子的活性来阻抗氧化应激损伤。这表明,当结肠上皮细胞受到氧化应激时候时,Grx可能在基因水平上参与了对抗H2O2的的作用,但另一方面也赋予了细胞良好的抗凋亡能力,从而在肿瘤的发生中起作用。

总之本实验结果首次在国内用体外实验方法证明H2O2可在一定时间和浓度范围内可明显上调Grx基因的表达,这提示通过深入研究氧化应激对结肠上皮细胞Grx的影响,可能为结肠癌发病机制提供一定的线索,也可能为结肠癌的治疗提供一种新策略。