BDE-47对玄蛤解毒代谢的影响

多溴联苯醚 (Polybrominated diphenyl ethers,PBDEs)是一类新型溴系阻燃剂 , 广泛应用于纺织、电子和建筑材料等产品中[1 3], 具有内分泌、生殖、神经、免疫等生物毒性[4 6]。根据溴原子在苯环上的数目和位置的不同, PBDEs 共有 209种同系物, 2009 年 5 月在《关于持久性有机污染物(POPs)的斯德哥尔摩公约》缔约方大会上将含有 4~7 个溴原子的 4 种 PBDEs 列入受控范围。PBDEs 可通过工业污水、废水排放和大气沉降等方式进入海洋环境中, 目前海洋 PBDEs 污染日益加重[7]。已有研究证明海洋环境中 PBDEs 的污染以低溴联苯醚(含 3~5 个溴原子)为主[8 11], 在海洋生物体内以四溴联苯醚(BDE-47)的含量为最高[12]。生物体细胞、生物化学和分子水平上的变化可最先反映污染物的毒性作用, 为环境污染提供早期的预警作用, 这些揭示污染物存在或生物体响应的指标被称为生物标志物。目前关于 PBDEs海洋环境污染的研究刚刚起步, 主要集中在PBDEs 在表层沉积物中的含量和贝类、鱼类中累积量测定方面的研究[13 15], 而有关 PBDEs 对水产动物毒性效应与评价的研究很少。菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)营滤食性生活、代谢率低, 对有机污染物具有很强的生物富集作用, 常被用作海洋环境监测的指示生物。作者研究了BDE-47 对菲律宾蛤仔鳃丝和消化盲囊解毒代谢基因表达的影响, 探讨了双壳贝类在 PBDEs 胁迫下的解毒代谢机制, 初步筛选了用于 PBDEs 毒性评定的分子生物标志物, 为中国海洋 PBDEs 污染监测提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用菲律宾蛤仔于 2009 年 11 月购于青岛市红岛贝类养殖场, 壳高(2.76±0.18) cm, 壳长(4.11±0.22) cm。实验前采用自然海水暂养 10 d,海水盐度为 31, pH 为 8.1, 温度为(9.0±0.5)℃, 连续充气, 日换水两次, 换水量为 1/2~2/3, 养殖密度为 8~10 个/L, 并投喂螺旋藻粉。

1.2 实验梯度设置

经 HPLC 检测, 实验用青岛近岸自然海水BDE-47 的含量为 0.013 ng/L, 实验梯度的设置主要依据中国香港近岸海水、表层沉积物中 PBDEs和 BDE-47 水平分别高达 448.5 pg/L、72.1pg/L 和53.6 ng/g、4.60 ng/g(DW)[14,16]以及 BDE-47 溶解度 10.9 μg/L, BDE-47 梯度设置为 0.25、6.25μg/L。实验所用 BDE-47 为 Accustandard 公司的产品, 采用丙酮作为助溶剂, 各处理组丙酮质量分数均为 0.002%, 并以自然海水组作为对照组,所有的实验梯度均设 3 个平行组。经预实验表明菲律宾蛤仔在自然海水组和含有 0.002%丙酮处理组中解毒代谢酶基因表达均无显著差异。实验在 50 cm×40 cm×30 cm 的塑料水槽内进行, 将暂养在自然海水中健康的菲律宾蛤仔随机分别移入各实验梯度中, 每个水槽放菲律宾蛤仔90 只, 实验期间的养殖管理与暂养期间完全相同,换水时分别加入对应各实验梯度的养殖用水。实验期间菲律宾蛤仔无死亡现象, 实验的取样时间为暴露后第 0、1、3、6、10、15 和 21 天。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备 每个水槽随机取 12 只菲律宾蛤仔置于冰盘中, 解剖取出鳃丝和消化盲囊, 去除多余的组织块, 分别放入液氮中充分研磨, 称取70~100 mg 粉末于 DEPC 处理过的 1.5 mL 的离心管中, 保存于 80℃冰箱中。

1.3.2 鳃丝、消化盲囊总 RNA 的提取 按照 Trizol试剂( Invitrogen 公司) 法[17 18]分别取80 mg鳃丝和消化盲囊组织样品, 加入 1 mL trizol 提取总RNA。测定 RNA 浓度以及 A260∶A280, 并且要求(A260∶A280)≥1.8; 用 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA 完整性。并加入 RNA 酶抑制剂 RNasin, 置于 80℃保存。

1.3.3 cDNA 模板制备 采用 20 μL 反转录体系,以上述制备的总 RNA 为模板, oligo dT 为引物合成 cDNA。产物保存在-20℃备用。

1.3.4 解毒代谢酶基因(AhR、CYP4、GST-pi 和Pgp)mRNA 表达的测定 采用 β-actin 作为内参, 根据本实验室提交的菲律宾蛤仔芳烃受体基因(AhR, FJ516743)、细胞色素 P450 第四亚族 (CYP4,FJ516740) 基因、谷胱甘肽硫转移酶基因(GST-pi,FJ516741)、P-糖蛋白基因(Pgp, FJ612109)全序列和部分序列设计引物, 并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成, 具体序列见表 1。以上述合成的 cDNA 为模板, 参照李彦飞等[17]和岳峰等[18]实验方法优化得到适宜的实验参数, 确立 AhR、CYP4、GST-pi 和 Pgp 基因及 β-actin 的 PCR 扩增反应体系为：10×Taq Buffer 2.5 μL, 2.5 mmol/LdNTP Mixture 2 μL, 上、下游引物各 1 μL, cDNA模板 2 μL, Taq DNA 聚合酶 0.5 μL, 加灭菌超纯水至 25 μL; 反应条件为：95℃预变性 3 min, 94℃变性 30 s, 58°C(AhR)/54℃(CYP4)/ 55℃(GST-pi)/60℃(Pgp)/56℃(β-actin)退火 45 s, 72℃延伸 45 s,AhR、CYP4、GST-pi、Pgp 和 β-actin 循环数依次为 38、30、30、32 和 28, 72℃延伸 7 min 后冷却至 4℃。反应结束后, 取 8 μL PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳, 利用AlphaEaseFC分析软件对PCR产物进行分析,以目的基因灰度值/内参 β-actin 灰度值的比值表示各个基因 mRNA 的相对表达水平。

1.4 数据处理与分析

所有数据均以 3 个平行组数据的平均值±标准差( x ±SD)表示, 并采用 SPSS 11.0 软件进行单因素方差分析(ANOVA)和 Duncan 检验法进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 BDE-47 对菲律宾蛤仔鳃和消化盲囊 AhR 基因表达的影响

由图 1 可见, BDE-47 对菲律宾蛤仔鳃丝和消化盲囊 AhR 基因表达影响显著(P<0.05), 而对照组无明显变化。各处理组鳃丝和消化盲囊 AhR 基因表达均呈峰值变化, 分别于第 6 天、第 1 天时达到最大值和最小值, 其中鳃的 AhR 基因表达在15 d 后恢复至对照组水平, 而 0.25、6.25 μg/L 处理组消化盲囊 AhR 基因表达分别于暴露后第 10天、 第 21 天恢复至对照组水平。

2.2 BDE-47 对菲律宾蛤仔鳃和消化盲囊 CYP4、GST-pi 基因表达的影响

如图2所示, 菲律宾蛤仔在 BDE-47胁迫下鳃和消化盲囊 CYP4、GST-pi 基因表达变化显著, 而对照组无明显变化。各处理组鳃 CYP4 基因表达呈峰值变化, 于第 3 天时达到最小值或最大值,其中 0.25 μg/L处理组仅在第 3天时低于对照组水平, 6.25 μg/L 处理组 10 d 后恢复至对照组水平;0.25、6.25 μg/L 处理组消化盲囊 CYP4 基因表达分别呈逐渐下降和先升高后下降趋势, 暴露 3 天后均保持稳定, 且被显著抑制。各处理组鳃和消化盲囊 GST-pi 基因表达均呈峰值变化, 分别于暴露后第 3 天和第 1 天、第 3 天时达到最大值或最小值, 6 d 后保持稳定, 且 0.25、6.25 μg/L 处理组分别高于和低于对照组水平。

2.3 BDE-47 对菲律宾蛤仔鳃和消化盲囊 Pgp 基因表达的影响

图 3 表明, BDE-47 对菲律宾蛤仔鳃和消化盲囊 Pgp 基因表达具有明显的影响(P<0.05), 而对照组无显著变化。各处理组鳃 Pgp 基因表达在实验时间内呈峰值变化, 分别于第 1 天、第 10 天时达到最大值, 均显著高于对照组水平, 其中 0.25μg/L 处理组在 3 d 后保持稳定; 0.25、6.25 μg/L 处理组消化盲囊 Pgp 基因表达在 21 d 内分别呈逐渐升高和峰值变化, 6 d 后表现为被诱导和抑制。

3 讨论

3.1 BDE-47 对菲律宾蛤仔组织解毒代谢基因表达的影响

已有研究表明, POPs 进入生物体细胞内一方面首先与受体蛋白(如芳烃受体蛋白)结合进入细胞核内, 介导Ⅰ相代谢酶基因如 CYP4 基因的表达, 从而合成相应的酶或蛋白, 将污染物转化为更具极性的代谢中间产物, 这些代谢产物会诱导Ⅱ相代谢酶基因如 GST-pi 的表达, 合成如谷胱甘肽硫转移酶等蛋白催化与 內源物质分子结合, 加速代谢产物排出体外[19 21]; 另一方面 POPs 入侵可以激活机体发生保护性的反应, 诱导以 Pgp 为代表的ABC跨膜转运蛋白基因表达升高, 合成P-糖蛋白将外源物质的转运至胞外[22]。薄军等[23]研究表明, 将真鲷(Pagrus major)暴露于 0.1~1.5 μg/L 苯并芘(B[α]P)中, 48 h 内肝脏AhR2 基因表达被显著诱导, 且与 B[α]P 的暴露浓度呈明显的剂量-效应关系; 据周驰等[24]和许超群等[25]报道多氯联苯(PCBs)和 B[α]P 可分别诱导翡翠贻贝(Perna viridis)CYP4 基因、菲律宾蛤仔GST-pi 基因的表达, 而且 CYP4、GST-pi 基因表达都与污染物浓度呈明显相关性; Nicholas 等[22]研究发现海虱 (Lepeophtheirus salmonis)在杀虫剂-甲氨基阿维菌素苯甲酸盐作用下, 10 μg/L 处理组 PgP1 基因被诱导的程度是对照组的 5 倍, 而30 μg/L 处理组 PgP1 基因被诱导的程度低于 10μg/L。本研究表明在 BDE-47 染毒时间内, 菲律宾蛤仔鳃丝和消化盲囊 AhR、CYP4、GST-pi 和 PgP基因表达均被显著诱导或抑制, 表现出明显的时间效应性, 这与上述研究结果不尽相同。由此表明, 菲律宾蛤仔在 BDE-47 胁迫下 AhR 的介导通路和 P-糖蛋白物质输出途径均参与了解毒代谢反应。作者认为 BDE-47 对菲律宾蛤仔解毒代谢基因表达的影响, 不仅与作用浓度和时间有关, 而且不同的组织器官解毒代谢基因表达表现出不同的变化过程, 其中组织 GST-pi 基因在低浓度处理组被诱导, 高浓度组被抑制, 表现出明显的时间效应性, 可作为BDE-47污染评价的生物效应指标。实验还表明菲律宾蛤仔解毒代谢基因表达水平 为鳃 丝>消化 盲囊 , 其中 鳃丝 基因 表达 与BDE-47 染毒浓度基本呈正相关性, 而消化盲囊基因表达在低浓度处理组诱导升高, 高浓度组被抑制, 这可能与鳃丝和污染物直接接触有关, 也与机体的解毒机制相关。作者认为 POPs 等污染物主要通过贝类摄食的水流进入鳃丝和消化道,通过血淋巴循环到达各组织器官(主要是消化盲囊), 菲律宾蛤仔在 BDE-47 作用下组织解毒代谢基因的表达变化不仅反映了解毒代谢过程, 也显示出机体所受的胁迫状态。

3.2 菲律宾蛤仔在 BDE-47 胁迫下组织解毒代谢基因表达的调控机制

Weiss 等[20]通过研究 TCCD 体外胁迫小鼠肝癌细胞(Hepa1)发现 AhR 可以与 ARNT 在核内形成二聚体, 诱导Ⅰ相和Ⅱ相解毒代谢酶基因的表达; 据 Wahl 等[21]报道 10 μmol/L 的 BDE-47 可以通过芳烃受体 AhR 的介导途径来影响斑马鱼(Danio rerio)CYP1A1 基因的表达。本研究表明菲律宾蛤仔在 BDE-47 作用下消化盲囊 AhR 与GST-pi 基因表达的变化基本一致, 而鳃丝 AhR 基因仅在低浓度处理组与 GST-pi 基因表达的变化趋势相近, 并且 2 种组织 AhR 基因均在高浓度组与 CYP4 基因表达趋于一致, 这与上述结果类似。同时实验还表明鳃的 AhR基因与 PgP基因表达在15 d 后表现为恢复至对照组水平和诱导升高, 而消化盲囊在低浓度处理组 10 d后 AhR基因和 PgP基因表达与鳃丝类似, 而在高浓度处理组均表现为被抑制。由此作者推测菲律宾蛤仔在 BDE-47作用下可通过AhR通路介导GST-pi基因表达, 而是否介导 CYP4 基因的表达尚需进一步验证, 也可能 CYP4 基因受其他受体蛋白的调控; 同时在BDE-47 胁迫下鳃中以 P-糖蛋白物质输出途径为主排出 BDE-47, 而消化盲囊中 BDE-47 的代谢途径与胁迫浓度相关, 两条代谢途径相辅相成, 共同促进机体对外源物质的代谢。