柳叶蜡梅叶氯仿部位化学成分的研究

[摘要] 为寻找柳叶蜡梅 Chimonanthus salicifoliu 叶中的抗肿瘤活性成分，对其氯仿部位进行了化学成分研究。通过正相硅胶柱色谱技术进行分离纯化，根据理化性质和光谱数据鉴定了12个化合物的结构，分别为9-epi-blumenol C（1），blumenol C（2），（+）-去氢催吐萝芙叶醇（3），（+）-催吐萝芙叶醇（4），robinlin（5），（-）-黑麦交酯（6），异秦皮定（7），东莨菪素（8），6， 7-二甲氧基香豆素（9），6， 7， 8-三甲氧基香豆素（10）， β-谷甾酮（11）， β-谷甾醇（12）。其中化合物1～6为蜡梅科植物中首次分离到的降倍半萜类化合物，化合物1为首次分离到的天然产物，化合物7，11和12为本植物中首次分离得到。

[关键词] 柳叶蜡梅；降倍半萜；香豆素；甾体

[收稿日期] 2013-04-30

[基金项目] 浙江省重大科技专项（2012C12014-1）；浙江省中医药科学研究基金项目（2012ZA0135）；浙江省丽水市科技局重点研究项目（2012JXKP018）

[通信作者] *程科军，Tel：（0578） 2173070，E-mail：；*俞培忠，Tel：（021） 51980103，E-mail： 柳叶蜡梅 Chimonanthus salicifolius S.Y. Hu为蜡梅科蜡梅属半常绿灌木，是中国特有属、种，主要产于安徽、江西、浙江[1]。又名食凉茶、伤风草、茅山茶、香风茶、黄金茶等[2]。畲族民间主要用于治疗因感受风寒而引起的肚痛、肚胀、腹泻，或伤食所致的消化不良、腹部胀痛和小儿疳积等症[3]，还用于防治感冒和流行性感冒[4]。柳叶蜡梅在现代药理研究中具有止泻、抑菌、抗炎、抗病毒等作用，其提取物对人宫颈癌细胞HeLa和人胃癌细胞SGC-7901的生长有抑制作用[2， 5]。对柳叶蜡梅化学成分的研究主要以挥发油（烯烃类，醇类和单萜、倍半萜类）为主[6-7]，其叶中还含有香豆素类，黄酮类，蒽醌类等成分[6， 8-9]。

本项目组前期进行的药理测试表明，柳叶蜡梅叶乙醇总提物的氯仿部位对多种肿瘤细胞显示良好的抑制活性，其中对人结直肠癌细胞HCT116和人肺癌细胞H1299的抑制活性较好，MTT法测定其IC50（作用时间为48 h）分别为56.5，27.9 mg·L-1。为此，作者对该部位的化学成分进行了研究，从中分离到了12个化合物，其中化合物1～6为蜡梅科植物中首次分离到的降倍半萜类化合物，化合物1为首次分离到的天然产物，化合物7～10为香豆素类化合物，化合物11，12为甾体类化合物，化合物7，11，12为本植物中首次分离得到。

1 材料

Varian Mercury Plus 400核磁共振测试仪，AVANCE III 500核磁共振仪，Agilent 1100 Series LC/MSD G194-6d型质谱仪，Finnigan MAT-95型质谱仪，SGW X-4显微熔点仪（温度计未校正），JASCO日本分光P-1020旋光仪，硅胶（300～400目）上海上邦实业有限公司，所用化学试剂均为分析纯。

柳叶蜡梅叶2011年7月采于浙江省丽水市柳叶蜡梅GAP种植基地，经丽水市食品药品检验所李建良副主任中药师鉴定为柳叶蜡梅 C. salicifolius 的干燥叶，标本保存于复旦大学药学院天然药物化学教研室。

2 提取与分离

柳叶蜡梅干燥叶5 kg经粉碎后，95%乙醇渗漉提取6次，每次12 h，合并渗漉液，减压回收乙醇至基本无醇味。加入适量水，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇各萃取3次，浓缩后得石油醚部分（50 g），氯仿部分（20 g），乙酸乙酯部分（4 g），正丁醇部分（5 g）。氯仿部分（20 g）硅胶柱色谱粗分，经石油醚-丙酮（100∶1～0∶1）梯度洗脱，共得到10个流分FrA～FrJ，对第5流分FrE（2.8 g）再进行硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮（6∶1～1∶1）梯度洗脱，得到7个流分FrE1～FrE7，FrE1硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯（40∶1）洗脱，得化合物11（10.2 mg），12（20.5 mg），FrE3硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯（8∶1）洗脱，得化合物9（43.3 mg），10（31.5 mg），FrE5硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯（5∶1～3∶1）洗脱，得化合物1（1.2 mg），2（7.1 mg），3（19.2 mg），6（3.4 mg）；对第7流分FrG（3.3 g）再进行硅胶柱色谱分离，经二氯甲烷-丙酮（1∶0～1∶1）梯度洗脱，得到14个流分FrG1～FrG14，FrG4硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯（3∶1）洗脱，得化合物7（42.3 mg），8（21.5 mg），FrG10硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯（2∶1）洗脱，得化合物5（45.1 mg），FrG13硅胶柱色谱以石油醚-丙酮（3∶1）洗脱，得化合物4（130.7 mg）。

3 结构鉴定

化合物1 无色油状物；[ α ]225 +73.0（ c 0.06，CHCl3）；ESI-MS m/z 211 [M+H]+。1H-NMR（CDCl3，400 MHz） δ ： 5.85（1H，s，H-4），3.79（1H，m，H-9），2.42（1H，d， J =17.0 Hz，H-2a），2.06（1H，d， J =17.0 Hz，H-2b），2.02（3H，d， J =1.2 Hz，H-13），1.92（1H，m，H-7a），1.90（1H，m，H-6），1.55（2H，m，H-8），1.45（1H，m，H-7b），1.24（3H，d， J =6.1 Hz，H-10），1.10（3H，s，H-11），1.09（3H，s，H-12）；13C-NMR（CDCl3，100 MHz） δ ： 34.8（C-1），45.6（C-2），198.0（C-3），123.7（C-4），164.1（C-5），49.5（C-6），24.8（C-7），37.2（C-8），66.6（C-9），22.3（C-10），25.8（C-11），27.3（C-12），23.2（C-13）。HSQC显示另外还存在1个季C、1个叔C原子及3个仲C原子，根据COSY和HMBC谱并对照byzantionoside B的水解产物9-epi-blumenol C的数据[10]，鉴定为9-epi-blumenol C，为首次分离到的天然产物。

化合物2 无色油状物；[ α ]225 +34.2（ c 0.35，CHCl3）；ESI-MS m/z 211 [M+H]+。1H-NMR（CDCl3，400 MHz） δ ： 5.82（1H，s，H-4），3.75（1H，m，H-9），2.38（1H，d， J =16.0 Hz，H-2a），2.02（1H，d， J =16.0 Hz，H-2b），2.00（3H，d， J =1.2 Hz，H-13），1.90（1H，m，H-6），1.90（1H，m，H-7a），1.52（2H，m，H-8），1.45（1H，m，H-7b），1.20（3H，d， J =6.1 Hz，H-10），1.06（3H，s，H-11），1.01（3H，s，H-12）；13C-NMR（CDCl3，100 MHz） δ ： 36.3（C-1），47.1（C-2），199.5（C-3），125.1（C-4），165.6（C-5），51.0（C-6），26.2（C-7），38.6（C-8），68.1（C-9），24.7（C-10），27.2（C-11），28.8（C-12），23.8（C-13）。以上数据与文献[11]对照基本一致，鉴定为blumenol C，化合物2与化合物1具有相同的分子量，二者的1H-NMR谱和13C-NMR谱的数据相似，考虑为化合物1的同分异构体。

化合物3 无色油状物；[ α ]205 +177.9（ c 0.96，CHCl3）；ESI-MS m/z 223 [M+H]+。1H-NMR（CDCl3，400 MHz） δ ： 6.83（1H，d， J =16.0 Hz，H-7），6.46（1H，d， J =16.0 Hz，H-8），5.94（1H，s，H-4），2.49（1H，d， J =16.0 Hz，H-2a），2.37（1H，d， J =16.0 Hz，H-2b），2.30（3H，s，H-10），1.88（3H，d， J =1.4 Hz，H-13），1.09（3H，s，H-11），1.01（3H，s，H-12）；13C-NMR（CDCl3，100 MHz） δ ： 41.4（C-1），49.5（C-2），197.6（C-3），127.7（C-4），160.7（C-5），79.2（C-6），145.2（C-7），130.3（C-8），197.2（C-9），28.3（C-10），22.9（C-11），24.3（C-12），18.7（C-13）。以上数据与文献[12]对照基本一致，鉴定为（+）-去氢催吐萝芙叶醇[（+）-dehydrovomifoliol]。

化合物4 无色半固体；[ α ]205 +160.3（ c 1.02，CHCl3）；ESI-MS m/z 225 [M+H]+。1H-NMR（CDCl3，400 MHz） δ ： 5.81（1H，s，H-4），5.72（1H，dd， J =16.0，5.0 Hz，H-8），5.67（1H，d， J =16.0 Hz，H-7），4.29（1H，dd， J =6.5，4.7，H-9），2.35（1H，d， J =17.0 Hz，H-2a），2.12（1H，d， J =17.0 Hz，H-2b），1.82（3H，d， J =1.0 Hz，H-13），1.18（3H，d， J =7.0 Hz，H-10），0.97（3H，s，H-11），0.93（3H，s，H-12）；13C-NMR（CDCl3，100 MHz） δ ： 41.2（C-1），49.6（C-2），199.2（C-3），126.4（C-4），164.8（C-5），78.9（C-6），128.9（C-7），135.6（C-8），67.8（C-9），24.0（C-10），22.9（C-11），23.5（C-12），19.3（C-13）。以上数据与文献[13]对照基本一致，鉴定为（+）-催吐萝芙叶醇[（+）-vomifoliol]。

化合物5 无色半固体；[ α ]205 +77（ c 1.01，CHCl3）；ESI-MS m/z 199 [M+H]+；1H-NMR（CDCl3，400 MHz） δ ： 4.25（1H，dd， J =14.0，6.0 Hz，H-6），3.75（1H，br s，H-9b），3.66（1H，m，H-9a），2.60（1H，m，H-8b），2.49（1H，m，H-8a），2.08（1H，dd， J =14.0，6.0 Hz，H-5b），1.82（3H，s，H-7），1.70（1H，t， J =13.0 Hz，H-5a），1.22（3H，s，H-10），1.16（3H，s，H-11）；13C-NMR（CDCl3，100 MHz） δ ： 200.1（C-1），129.4（C-2），161.6（C-3），37.3（C-4），45.1（C-5），69.2（C-6），12.0（C-7），34.2（C-8），60.7（C-9），25.3（C-10），29.4（C-11）。以上数据与文献[14]对照基本一致，鉴定为robinlin。

化合物6 无色半固体；[ α ]225-54.2（ c 0.17，CHCl3）；ESI-MS m/z 197 [M+H]+；1H-NMR（CDCl3，600 MHz） δ ： 5.69（1H，s，H-2），4.33（1H，m，H-5），2.47（1H，ddd， J =14.0，3.2，1.3 Hz，H-6a），1.98（1H，ddd， J =14.0，3.4，1.4 Hz，H-4a），1.79（1H，ddd， J =14.0，3.2，1.3 Hz，H-6b），1.78（3H，s，H-11），1.62（1H，d， J =8.2 Hz，H-7），1.53（1H，ddd， J =14.0，3.4，1.4 Hz，H-4b），1.47（3H，s，H-8），1.27（3H，s，H-9）；13C-NMR（CDCl3，150 MHz） δ ： 182.4（C-1），112.9（C-2），86.7（C-3），45.6（C-4），66.9（C-5），47.3（C-6），35.9（C-7），26.5（C-8），27.0（C-9），171.9（C-10），30.7（C-11）。以上数据与文献[15]对照基本一致，鉴定为（-）-黑麦交酯[（-）loliolide]。

化合物7 淡黄色针晶（MeOH）；mp 145～146 ℃；EI-MS m/z 222 [M]+；1H-NMR（Me2CO-d6，400 MHz） δ ： 7.84（1H，d， J =9.5 Hz，H-4），6.97（1H，s，H-5），6.20（1H，d， J =9.5 Hz，H-3），3.95（3H，s，8-OMe），3.93（3H，s，6-OMe）。以上数据与文献[16]对照基本一致，鉴定为异秦皮定（isofraxidin）。

化合物8 淡黄色针晶（MeOH）；mp 210～211℃；EI-MS m/z 192 [M]+；1H-NMR（Me2CO-d6，400 MHz） δ ： 7.85（1H，d， J =9.5 Hz，H-4），7.20（1H，s，H-5），6.80（1H，s，H-8），6.18（1H，d， J =9.5 Hz，H-3），3.90（3H，s，6-OMe）。以上数据与文献[2，16]对照基本一致，鉴定为东莨菪素（scopoletin）。

化合物9 无色针晶（MeOH）；mp 141～142 ℃；ESI-MS m/z 207 [M+H]+；1H-NMR（CDCl3，400 MHz） δ ： 7.62（1H，d， J =9.5 Hz，H-4），6.85（1H，s，H-5），6.82（1H，s，H-8），6.28（1H，d， J =9.5 Hz，H-3），3.94（3H，s，7-OMe），3.91（3H，s，6-OMe）。以上数据与文献[16]对照基本一致，鉴定为6，7-二甲氧基香豆素（6，7-dimethoxycoumarin）。

化合物10 无色针晶（MeOH）；mp 83～84 ℃；ESI-MS m/z 237 [M+H]+。1H-NMR（CDCl3，400 MHz） δ ： 7.62（1H，d， J =9.5 Hz，H-4），6.67（1H，s，H-5），6.36（1H，d， J =9.5 Hz，H-3），3.90，4.00，4.04（各3H，s，-OMe）。以上数据与文献[17]对照基本一致，鉴定为6，7，8-三甲氧基香豆素（6，7，8-trimethoxycoumarin）。

化合物11 白色针晶（MeOH）；mp 84～85 ℃；[ α ]225 +66.0（ c 0.51，CHCl3）；ESI-MS m/z 413 [M+H]+。1H-NMR（CDCl3，600 MHz） δ ： 5.72（1H，s，H-4），1.18（3H，s，H-19），0.92（3H，d， J =8.0 Hz，H-21），0.85（3H，s，H-29），0.82（3H，s，H-26），0.81（3H，s，H-27），0.71（3H，s，H-18）；13C-NMR（CDCl3，150 MHz） δ ： 35.6（C-1），34.0（C-2），199.6（C-3），123.8（C-4），171.7（C-5），33.0（C-6），32.1（C-7），35.6（C-8），53.8（C-9），38.6（C-10），21.0（C-11），39.6（C-12），42.4（C-13），55.9（C-14），28.2（C-15），24.2（C-16），56.0（C-17），12.0（C-18），17.4（C-19），36.1（C-20），18.7（C-21），33.9（C-22），26.1（C-23），29.2（C-24），45.8（C-25），19.8（C-26），19.0（C-27），23.1（C-28），12.0（C-29）。以上数据与文献[18]对照基本一致，鉴定为 β-谷甾酮（ β-sitostenone）。

化合物12 白色针晶（MeOH），mp 135～136 ℃，[ α ]235-35.5（ c 0.52，CHCl3）；ESI-MS m/z 415 [M+H]+。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）和13C-NMR（CDCl3，100 MHz）数据与文献[19]对照基本一致，鉴定为 β-谷甾醇（ β-stigmasterol）。

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Chemical constituents of chloroform fraction from leaves of

Chimonanthus salicifolius

ZHANG Yao HUA Jin-wei2，3， WANG Xiu-yan CHENG Wen-liang2，3， LEI Hou-xing4，

CHENG Ke-jun2，3*， YU Pei-zhong（1.School of Pharmacy， Fudan Univerisity， Shanghai 201203， China；

2. Lishui Institute of Agricultural Sciences， Lishui 323000， China；

3. Lishui Agricultural Science and Technology Development Company， Lishui 323000， China；

4. Lishui People′s Hospital， Lishui 323000， China）

[Abstract] To explore anti-tumor active components of Chimonanthus salicifolius ， the phytochemistry of the chloroform fraction from leaves extract was investigated by repeated silica gel column chromatography. Twelve compounds were isolated and their structures were identified by physicochemical properties and spectroscopic data analysis as 9-epi-blumenol C（1）， blumenol C（2）， （+）-dehydrovomifoliol（3）， （+）-vomifoliol（4）， robinlin（5）， （-）-loliolide（6）， isofraxidin（7）， scopoletin（8）， 6， 7-dimethoxycoumarin（9）， 6， 7， 8-trimethoxycoumarin（10）， β-sitostenone（11）， and β-stigmasterol（12）. Compounds 1-6 belonging to nor-sesquiterpenoids were isolated from the family Calycanthaceae for the first time. Compound 1 was a new natural product. Compounds 7， 11 and 12 were obtained from this plant for the first time.

[Key words] Chimonanthus salicifolius ； nor-sesquiterpenoids； coumarins； steroids

doi：10.4268/cjcmm20131624