去铁胺对帕金森SHSY5Y细胞的保护作用

[摘要] 目的 探讨铁螯合剂去铁胺对MPP+诱导的帕金森病细胞模型的保护作用。 方法 培养SHSY5Y细胞，去铁胺预处理或未处理1 h，再给予MPP+48 h。利用MTT法检测细胞活力，Western blotting法检测CHOP和Caspase-12的表达，利用ROS特异性染料H2DCF-DA标记胞内ROS。 结果 SHSY5Y细胞给予MPP+后细胞活力显著下降，内质网应激相关蛋白CHOP和Caspase-12的表达增加。表明去铁胺预处理后显著减轻MPP+所致的细胞损伤，同时降低内质网应激相关蛋白CHOP和Caspase-12的表达，并且去铁胺能够抑制ROS生成。 结论 去铁胺对MPP+制备的帕金森SHSY5Y细胞具有保护作用，与其抑制内质网应激作用相关。

[关键词] 去铁胺；SHSY5Y细胞；内质网；帕金森病

[中图分类号] R742.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）03-0007-03

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是第二大常见的中枢神经系统退行性疾病，主要的病理变化是中脑黑质多巴胺能神经元进行性丢失和富含α-synuclein蛋白的路易氏小体沉积[1]。目前PD的发病机理主要包括氧化应激、兴奋性毒性、线粒体损伤和神经炎症等假说[2]，但并不知道PD确切的发病机制。研究发现无论是在PD患者还是动物模型中，中脑铁沉积都显著增加。铁可以通过Fenton反应促进自由基的生成，对神经元造成氧化损伤，最终导致神经元的死亡[3]。目前已报道铁螯合剂去铁胺对6-OHDA制备的大鼠PD模型具有保护作用[4]。但是在PD中并未有其与内质网应激关系的报道。

1 材料与方法

1.1 SHSY5Y细胞培养与给药

SHSY5Y细胞用含有10%胎牛血清的DMEM，置于37℃ 5%CO2的细胞培养箱中培养。给药：预先给予或不给予去铁胺（Sigma）1 h，再给予MPP+（400 μM，Sigma）48 h后进行实验。

1.2 MTT测定

将细胞种在96孔板中，药物处理完毕后，弃培养液，加入含有MTT（0.5 mg/mL）的DMEM，置于细胞培养箱中孵育4 h。弃上清，加入200 μL DMSO溶解，利用酶标仪（Vario Skan Flash，3001，Thermo Scientific）在290 nm处读取吸光度。该实验分别独立进行四次，结果以对照组作为参照（设为100%）。

1.3 LDH测定

经药物处理完毕后，搜集细胞上清，利用LDH检测试剂盒（建成生物）测定细胞LDH释放量，按照说明书进行操作。利用酶标仪（Vario Skan Flash， 3001， Thermo Scientific） 在490 nm处读取吸光度。该实验分别独立进行四次，结果以对照组作为参照（设为100%）。

1.4 Western blotting

细胞种于六孔板中，药物处理完毕后，吸弃培养液，置于冰上。加入冰D-Hank’s液洗涤两遍，再加入Rippa蛋白裂解液冰上裂解45 min。用细胞刮刮下细胞，转至EP管，12 000 rpm，4 ℃离心25 min。取上清，加入5×上样缓冲液，沸水煮5 min。通过BCA（碧云天）蛋白定量法确定蛋白浓度。以100 μg蛋白量上样于12% SDS-PAGE进行凝胶电泳，4℃ 300 mA电转90 min。5% BSA-TBST封闭1 h后，加入兔抗GRP78抗体（1∶1 000，Cell signaling Technology），小鼠抗CHOP抗体（1∶1 000，Cell signaling Technology），兔抗Caspase-12抗体（1∶1 000，Cell signaling Technology），小鼠抗β-actin抗体（1∶1 000，博士德）4 ℃过夜。TBST漂洗10 min×3次后，加入HRP标记的二抗羊抗小鼠-HRP二抗，羊抗兔-HRP二抗（1∶800，北京中杉）室温孵育1 h后加入ECL（Pierce）发光底物显色。Omega 16IC全自动化学发光凝胶成像系统显影分析。利用Imagine J分析条带光密度值。

1.5 胞内ROS含量测定

利用ROS特异性染料H2DCF-DA标记胞内ROS。药物处理完毕后，加入25μM的H2DCF-DA孵育30 min。孵育完毕后，用冰PBS洗涤3遍，最后用酶标仪在530 nm和485 nm双波长读取吸光度。该实验分别独立进行四次，结果以对照组作为参照（设为100%）。

1.6 统计学方法

所有数据均采用（x±s）表示，采用SPSS 16.0统计软件对数据进行录入与分析，应用t检验进行统计学分析。P

2 结果

2.1 去铁胺对细胞活力的影响

SHSY5Y细胞给予400 μM MPP+后，细胞活力显著下降，较对照组下降约33%（表1，P < 0.001）。分别预先给予25 μM、50 μM和100 μM去铁胺1 h，结果显示，25 μM去铁胺对MPP+引起的细胞损伤无保护作用，但50 μM和100 μM去铁胺对MPP+引起的细胞损伤均具有保护作用（表1，P < 0.01）。同时我们测定了细胞培养基中LDH，结果显示，MPP+刺激后显著诱导细胞LDH释放（表1，P < 0.01）。分别添加25 μM、50 μM和100 μM去铁胺预处理1 h，发现25 μM去铁胺对MPP+引起的LDH释放无抑制作用，但50 μM和100 μM去铁胺均能抑制MPP+引起的细胞LDH释放（表1，P < 0.01），表明去铁胺能减轻MPP+诱导的细胞损伤。因此，我们选择50 μM进行后续试验。

2.2 去铁胺对内质网应激的影响

Western blotting结果显示，SHSY5Y细胞给予400 μM MPP+后，内质网应激相关蛋白Caspase-12和CHOP表达显著增加（图1，P < 0.01）。当预先给予50 μM去铁胺后能够显著抑制Caspase-12和CHOP的表达（图1，P < 0.05），表明去铁胺能够抑制MPP+引起的内质网应激。

2.3 去铁胺对ROS的影响

见表2。

表2 ROS测定结果（以对照组为100%）（x±s）

注：与对照组比较，**P < 0.01；与MPP+组比较，#P < 0.05；去铁胺浓度为50 μM

3 讨论

近年来内质网应激作为PD新的发病机制已经进入人们的视野。内质网作为细胞内蛋白质合成的主要场所，负责蛋白质正确的加工折叠。而α-synuclein是与PD密切相关的蛋白，在病理情况下发生异常折叠积聚，引起内质网应激。本文通过制备PD细胞模型，研究发现铁螯合剂去铁胺能减轻MPP+导致的细胞损伤，并且这一作用可能是通过抑制内质网应激发挥的。

PD是常见的神经系统退行性疾病，表现为多巴胺能神经元进行性丢失。尽管目前有很多关于PD病理机制的假说，但我们并不知道其确切的发病机制。近年来内质网应激在PD研究中逐渐受到重视。内质网是细胞蛋白质合成的主要场所，负责蛋白质正确的组装与折叠，当蛋白质异常折叠时能够引发错误折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPS）。UPS主要由位于内质网上的三个敏感蛋白激发：PERK，通过磷酸化eIF2a广泛抑制蛋白质的翻译；IRE-1，剪切转录因子XBP1的mRNA，促进XBP1表达，进而上调伴侣分子基因的表达；ATF-6，位于内质网膜上的转录因子，在UPS中发生核转位，促伴侣分子表达。UPS的目的是维持内质网的稳定，停止蛋白质的合成，促进蛋白质降解，增加伴侣分子表达，促进蛋白质的正确折叠，但是当UPS持续存在是能够启动凋亡通路[5]。α-synuclein是PD中重要的病理蛋白，在PD的患者和动物模型中均发现了α-synuclein的异常积聚。已经有研究表明异常折叠的α-synuclein能够激发内质网应激，并且激活CHOP和Caspase-12，促进Caspase-12剪切，最终激活Caspase-3造成神经元凋亡[6-8]。

PD中另一个表现是中脑黑质区铁沉积增加，目前这一现象的机制并不明了[9]。但是过多的铁能够发生Fenton反应，促进自由基生成，引起氧化应激，造成神经元损伤[10]。现在已有铁螯合剂去铁胺对PD动物模型的报道，但是尚未有去铁胺对内质网应激影响的报道。我们发现去铁胺能抑制MPP+引起的内质网应激，同时我还发现去铁胺能抑制MPP+诱导的ROS生成，SHSY5Y细胞经MPP+孵育48 h后ROS生成显著增加，是对照组的1.5倍左右（表2，P < 0.01）。而预先给予50 μM的去铁胺后能显著抑制MPP+诱导的ROS生成（表2，P < 0.05），这些可能都是去铁胺发挥保护多巴胺能神经元的作用机制。

本研究表明铁螯合剂去铁胺能抑制内质网应激和ROS产生发挥对多巴胺能神经元的保护作用，揭示了其新的作用机制。

[参考文献]

[1] Lees AJ，Hardy J，Revesz T. Parkinson's disease[J]. Lancet，2009，373（9680）：2055-2066.

[2] Schapira AH，Jenner P. Etiology and pathogenesis of Parkinson's disease[J]. Mov Disord，2011，26（6）：1049-1055.

[3] Lee HP，Zhu X，Liu G，et al. Divalent metal transporter， iron，and Parkinson's disease：a pathological relationship[J]. Cell Res，2010，20（4）：397-399.

[4] Ben-Shachar D，Eshel G，Finberg JP，et al. The iron chelator desferrioxamine（Desferal） retards 6-hydroxydopamine-induced degeneration of nigrostriatal dopamine neurons[J]. J Neurochem，1991，56（4）：1441-1444.

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[6] Bernales S，Soto MM，McCullagh E. Unfolded protein stress in the endoplasmic reticulum and mitochondria：a role in neurodegeneration[J]. Front Aging Neurosci，2012，4：5.

[7] Hoozemans JJ，Scheper W. Endoplasmic reticulum：The unfolded protein response is tangled in neurodegeneration[J]. Int J Biochem Cell Biol，2012，44（8）：1295-1298.

[8] 潘凤英，贾国强，巴晓红. 内质网应激与帕金森病的研究进展[J]. 临床神经病学杂志，2011，24（1）：78-79.

[9] 姜宏，陈文芳，谢俊霞. 帕金森病模型大鼠脑内多巴胺与铁含量的关系[J]. 生理学报，2001，53（5）：329-333.

[10] Mattson MP. Nitro-PDI incites toxic waste accumulation[J]. Nat Neurosci，2006，9（7）：865-867.

（收稿日期：2012-09-17）