艾拉莫德对胶原诱导性关节炎大鼠模型的抗炎作用

【摘 要】目的：研究艾拉莫德对牛Ⅱ型胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠模型的抗炎作用。

方法：将40只6周龄Wistar雌性大鼠随机分成空白对照组、模型对照组、甲氨蝶呤组、艾拉莫德组，每组10只。除空白对照组外，其余各组以Ⅱ型胶原和冰醋酸制备CIA模型。空白对照组和模型对照组给予生理盐水灌胃，甲氨蝶呤组给予甲氨蝶呤2.5 mg・kg-1，每周1次灌胃，艾拉莫德组给予艾拉莫德10 mg・kg-1・d-1灌胃。观察各组大鼠关节肿胀度、滑膜病理变化，ELISA法检测艾拉莫德对大鼠血清白细胞介素（IL）-1、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平的影响。结果：艾拉莫德可明@改善CIA大鼠关节滑膜病理，可明显减轻CIA大鼠关节肿胀，下调血清IL-1、IL-1β、TNF-α水平，且艾拉莫德组优于甲氨蝶呤组，差异有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05）。结论：艾拉莫德对CIA模型鼠关节滑膜有保护及明显的抗炎作用，其机制可能与下调致炎因子IL-1、IL-1β、TNF-α水平有关。

【关键词】 关节炎，类风湿；胶原诱导性关节炎；艾拉莫德；关节滑膜病理；IL-1；IL-1β；TNF-α；大鼠

Anti-inflammatory Effect of Iguratimod on Collagen-induced Arthritis Rat Models

HUANG Ying，YAO Xue-ming，TANG Fang，XU Hui，WANG Ying，MA Wu-kai

【ABSTRACT】Objective：To study the anti-inflammatory effect of Iguratimod on bovine type Ⅱ collagen-induced arthritis rat models（CIA models）.Methods：Forty six-week female Wistar rats were randomly divided into a blank control group，a model control group，a methotrexate group and an Iguratimod group，with ten rats in each.Except the blank control group，CIA models were established in the other groups with collagen typeⅡ and glacial acetic acid.The blank control group and the model control group were given intragastric administrations respectively with normal saline，the methotrexate group was given intragastric administrations with 2.5 mg・kg-1 of methotrexate，once a week，while the Iguratimod group was given intragastric administrations with 10 mg・kg-1 ・d-1

of Iguratimod，observing the swelling degree and the pathological changes of synovial membrane.ELISA method was used to detect the effects of Iguratimod on the levels of IL-1，IL-1β and TNF-α.Results：Iguratimod could significantly improve the pathology of synovial tissue in CIA rats，obviously reduce their joint swelling，and down regulate the levels of IL-1，IL-1β and TNF-α in them，the Iguratimod group being better than the methotrexate group and the difference being statistically significant（P < 0.01 or P < 0.05）.Conclusion：Iguratimod has protective and anti-inflammatory effects on CIA rat models，whose mechanism may be related to the down-regulation of inflammatory factors IL-1，IL-1β and TNF-α.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid；collagen-induced arthritis；Iguratimod；synovial membrane pathology；

IL-1；IL-1β；TNF-α；rats

艾拉莫德（T-614）是一种新型的具有多作用靶点的抗风湿药物，在相关临床观察中具有良好的疗效及耐受性[1]，治疗RA主要的作用机制为抗炎、抑制免疫球蛋白合成、抑制细胞因子生成、抑制骨吸收和促进骨形成[2]。白细胞介素-1（IL-1）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是RA滑膜炎症发生发展过程中重要的细胞因子[3-4]。本实验主要通过建立胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠模型，研究艾拉莫德对CIA模型大鼠关节滑膜病理及血清IL-1、IL-1β、

TNF-α水平的影响，探讨该药的抗炎作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 6周龄健康清洁级雌性Wistar大鼠40只，体质量（170±15）g，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK（京）2012-0001。适应性喂养1周。

1.2 主要试剂与设备 牛Ⅱ型胶原、弗氏完全佐剂（美国Sigma公司，生产批号分别为C7806-2、F5881）；醋酸（上海国药集团试剂公司，生产批号T20100913）；大鼠IL-1、IL-1β、TNF-α ELISA试剂

盒（武汉华美生物工程公司，生产批号分别为CSB-E04622r、CSB-E08055r、CSB-E11987r）；电热恒温水浴锅（北京市长风仪器公司，型号HW.SY11-KP2）。

1.3 药 物 艾拉莫德片（先声药业有限公司，国药准字H20110084）；甲氨蝶呤片（上海信谊药厂有限公司，国药准字H31020644）。

2 方 法

2.1 动物分组 将40只Wistar大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、艾拉莫德组、甲氨蝶呤组，每组10只。

2.2 模型制备 空白对照组不做任何处理，其余各组大鼠按照参考文献[5]将牛Ⅱ型胶原溶于质量分数为0.1%的冰醋酸中，按比例与弗氏完全佐剂1∶1充分混和乳化，于Wistar大鼠右后足跖肉垫内注射0.4 mL，第7天以相同乳剂及剂量于大鼠尾根部加强注射。

2.3 给药方法 从第2次免疫后开始灌胃，艾拉莫德组大鼠给予艾拉莫德10 mg・kg-1・d-1；甲氨蝶呤组给予甲氨蝶呤2.5 mg・kg-1，每周1次；空白对照组、模型对照组均给予生理盐水。共给药4周。

2.4 关节肿胀率 用游标卡尺测量大鼠左后肢踝关节的直径（mm），每周测1次。以第1天测得值为基值，以后的测得值与基值的比值即为关节肿胀率。

2.5 TNF-α、IL-1、IL-1β检测 给药4周后，大鼠股动脉取血，离心取上清液，严格按照ELISA试剂盒操作检测。加入准备好的样品和标准品，

37 ℃反应30 min，洗板5次；加入酶标试剂，37 ℃

反应30 min，洗板5次；加入显色液A、B，37 ℃显色10 min，加入终止液；最后绘制标准曲线，依据曲线方程式计算各样本浓度值。

2.6 关节滑膜病理情况 麻醉处死大鼠取血后，取右后踝关节滑膜组织，EDTA脱钙，常规梯度脱水、石蜡包埋、切片，HE染色。光镜下观察关节滑膜细胞和血管的增生、滑膜层及滑膜下层淋巴细胞浸润等情况。

2.7 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以表示，符合正态分布满足方差齐性，采用单因素分析；不符合正态分布，采用非参数（秩和）检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组大鼠关节滑膜病理表现 空白对照组大鼠关节滑膜未见炎性细胞浸润及纤维组织增生；模型对照组滑膜组织见大量淋巴细胞、浆细胞及较多中性粒细胞浸润，并见关节软骨破坏及关节内纤维组织增生；甲氨蝶呤组滑膜组织见较多淋巴细胞、少量中性粒细胞浸润，部分滑膜腔和关节腔内见炎性渗出物；艾拉莫德组近关节腔的滑膜结构较正

常，其他组织内可见少量淋巴细胞浸润。见图1。

3.2 各组大鼠各时间点关节肿胀率比较 治疗前，各造模组关节肿胀率与空白对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；造模7 d时，各模型对照组关节肿胀率开始上升，14 d时达到高峰，模型对照组关节肿胀率与空白对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）；21～28 d时，艾拉莫德组、甲氨蝶呤组关节肿胀率明显下降，与模型对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）；艾拉莫德组与甲氨蝶呤组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）。见表1。

3.3 各组大鼠血清IL-1、IL-1β、TNF-α的表达

与空白对照组比较，模型对照组IL-1、IL-1β、TNF-α表达升高，差异有统计学意义（P < 0.01）；与模型对照组比较，艾拉莫德组、甲氨蝶呤组IL-1、IL-1β、TNF-α的表达明显下降，差异有统计学意义（P < 0.01）；艾拉莫德组优于甲氨蝶呤组，差异有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05）。见表2。

4 讨 论

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是临床最常见的风湿免疫性疾病之一，发病率高，病情呈慢性过程，迁延反复，致残率高，严重影响患者健康及生存质量。本病基本病理为关节滑膜炎，活动期关节滑膜充血、水肿、纤维素样坏死，并伴大量炎性细胞浸润[6]。CIA大鼠模型发病机制、临床表现、病理以及免疫学特征均与RA最为相近[7]，

故被广泛用于RA发病及治疗机制的研究。

在RA滑膜炎的启动和持续中，众多炎性细胞因子发挥了重要作用[8-9]，其中最重要的IL-1和TNF-α，两者通常同时存在，协同作用，并互相促进。它们通过活化内皮细胞，增强内皮细胞黏附分子表达，将血液中与黏附分子相互作用的白细胞聚集到关节腔而发挥致炎作用[10]；促进滑膜细胞和软骨细胞合成并释放前列腺素E2，诱发滑膜炎[11]；合成并释放胶原酶，促进分泌纤维蛋白溶酶原激活剂，转换纤维蛋白溶酶原成纤维蛋白溶酶，从而降解纤维蛋白，使软骨基质崩解[12]。IL-1中发挥生物学活性的主要为IL-1β，参与RA的软骨破坏和骨侵蚀，因此，IL-1β和TNF-α在RA复s的细胞因子网络中发挥关键作用[11]。CIA模型大鼠血清中IL-1、IL-1β和TNF-α水平在治疗前显著升高，治疗后明显下降，提示IL-1、IL-1β和TNF-α水平的高低可在一定程度上体现CIA模型大鼠关节炎症的严重程度[13]。

实验结果显示，与空白对照组比较，各造模组左踝关节肿胀率明显升高（P < 0.01），经艾拉莫德治疗后CIA大鼠踝关节肿胀率明显下降，且根据关节肿胀率随治疗时间的变化情况，提示艾拉莫德较甲氨蝶呤起效更快；经艾拉莫德治疗后的CIA大鼠滑膜组织病理最接近空白对照组；艾拉莫德可明显降低CIA大鼠血清IL-1、IL-1β、TNF-α水平。本次实验也证明了艾拉莫德可通过下调IL-1、IL-1β、

TNF-α水平，从而改善关节滑膜病理，发挥抗炎、保护关节软骨、缓解RA病情的作用。通过本实验可以使临床医师更加了解艾拉莫德的抗炎作用机制，对治疗RA可起到一定指导作用。本研究不足之处是艾拉莫德仅设立一个剂量组，量效关系体现不明确，尚待今后更多浓度梯度实验。

参考文献

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收稿日期：2016-10-23；修回日期：2016-12-08