焦磷酸测序中PCR引物与测序引物的设计

摘要：利用焦磷酸测序技术进行核酸序列测定时，测序信号过低或非特异性信号过高均会导致测序失败。因此， PCR引物与测序引物的设计十分重要。本研究以rs8175347为例，通过设计具有不同多聚酶亲和指数（PPI）的PCR引物，并运用焦磷酸测序测定其扩增产物，考察了PPI值对扩增效率以及测序信号的影响；以rs914232、rs671位点为例，对比不同测序方向以及dNTP的推注顺序，考察了两者对测序结果的影响。结果表明，提高PCR引物的PPI值有助于增强扩增效率与测序结果的信号峰强度，测序方向和dNTP推注顺序的不合理选择会严重干扰部分SNP测序结果的判断。因此，在设计PCR引物时，应将多聚酶亲和指数理论与传统基于解链温度值的引物设计思路相结合，为焦磷酸测序提供高质量的测序模板；在进行定量测序时，还要综合考虑待测位点（SNP）两侧的序列，选择合适的测序方向以及dNTP的推注顺序，使测序结果更加准确。

关键词：焦磷酸测序； PCR引物； 测序引物

1引言

焦磷酸测序技术[1]的测序原理是： 引物与模板DNA退火后， 在DNA 聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶等4 种酶的协同作用下完成循环测序反应。当加入的dNTP与模板互补时，1 pmol DNA模板与互补的dNTP聚合时可以产生等摩尔PPi，在三磷酸腺苷硫酸化酶的催化下，PPi与5′磷酸化硫酸腺苷反应生成等量的ATP；荧光素酶催化作用下，ATP与虫荧光素反应生成氧化虫荧光素并发出等量的可见光，可用光电转换装置检测。产生的荧光信号以峰的形式出现，其强度与聚合的dNTP 个数成正比，根据加入的dNTP类型和测得的荧光信号强度就可实时记录模板DNA 的核苷酸序列。

焦磷酸测序技术以其准确、快速、简便的技术特点，在单核苷酸多态性分析[2，3]、等位基因频率测定[4，5]、微生物鉴定分型[6，7]、甲基化分析[8]、表达量测定[9]等方面的应用中展现了巨大的优势。然而，在利用焦磷酸测序技术进行核酸序列测定时，常因测序信号过低或出现过高的非特异性背景信号而使测序失败，无法得到正确的核酸序列信息，前者主要由于PCR扩增引物的扩增效率不高，造成扩增产物浓度低，无法制备得到足够多的单链测序模板；后者则是因为测序引物与模板在非待测区域产生错配延伸或是测序引物自身形成了二聚体延伸产生了非特异性信号，干扰了测序结果。因此，要获得准确可靠的焦磷酸测序结果，扩增引物与测序引物的设计十分重要，有必要系统研究焦磷酸测序中引物的设计方法。

测序结果的准确性既受扩增引物特异性的影响，也受测序引物特异性的影响。当测序引物3′末端与待测模板错配或测序引物自身形成二聚体，产生的信号超过dNTP的本底信号时，焦磷酸测序中会出现非特异性信号，干扰结果的准确判读。因此，精确设计测序引物3′末端的序列或调整扩增产物长度，可减少测序引物与待测模板其它区域的错配，降低或消除非特异性测序信号。此外，优化测序引物的序列， 可避免引物二聚体的生成，防止因二聚体的形成而大量消耗测序引物，降低测序信号或增加非特异性信号。

3.2提高焦磷酸测序定量性能的方法

运用焦磷酸测序对SNP分型时，不仅需要参照上述PCR引物和测序引物的设计原则，还应结合SNP附近的碱基序列，选择待测位点的正义链或反义链， 尽量避免序列中的同质区，同时优化dNTP加入顺序，以获得可准确分型的焦磷酸测序图谱。

以测定rs671位点为例，当生物素标记下游引物时，测序引物延伸序列为GAAAGT。该位点为纯合野生型或突变杂合型时，“G”、“A”信号峰强度比值应分别等于1∶2或1∶5。但在实际样本的测序图谱中，纯合野生型和突变杂合型的“G”、“A”信号峰强度比值分别为1∶2（图2a）和1∶3.6（图2b），这一结果与理论值相差较大。

然而，若测定PCR产物反义链序列，测序引物延伸序列即为CTAG，判定纯合野生型只要根据峰的有无，不需计算等位基因比例（图2c）；对于杂合型的该位点，则“C”、“T”信号峰同时出现（图2d）。理论上一次焦磷酸测序反应中，聚合dNTP的个数与信号峰强度成正比，但是如果一次聚合4个或4个以上dNTP，则可能出现测序误差[12]。因此，为了准确直观地测定基因型，需对比待测位点附近正义链与反义链的序列，避免在同质区一次性聚合多个dNTP。

对有些SNP位点，不能简单通过选择正义链或反义链来回避SNP附近复杂的碱基组成。以位于21号染色体上的rs914232位点为例（该位点杂合子的等位基因比例用于判定样本是健康人或唐氏综合症患者），针对该位点无论选择正义链或反义链，都无法使测序结果中杂合子的等位基因比例为1∶1（健康人），1∶2或2∶1（唐氏综合症患者）。研究发现，通过优化测序时dNTP的加入顺序，焦磷酸测序图谱能较好区别健康人杂合子和唐氏综合症患者杂合子。如图3所示，当dNTP以“TCAG”的顺序加入时，健康人杂合子和唐氏综合症患者杂合子的“C”、“T” 信号峰强度比值分别为3∶1（图3a）和5∶1（图3b），两种基因型的焦磷酸测序图谱差异非常明显。但是，当dNTP以“CTAG”顺序加入时，健康人杂合子和唐氏综合症患者杂合子的“C”、“T”信号峰强度比值分别为1∶1.5（图3c）和1∶1.25（图3d），两种基因型的焦磷酸测序图谱差异不明显，难以判断临床样本的基因型。因此，为了得到准确的判断结果，应根据待测靶标优化dNTP的加入顺序。

4结论

本研究通过分析3个不同SNP的测序结果，研究了焦磷酸测序中PCR引物与测序引物的设计方法。研究结果表明，将多聚酶亲和指数理论与传统依据Tm值的设计思路相结合，可显著提高PCR引物的扩增效率，满足了焦磷酸测序对模板量的要求；通过对比待测位点附近正义链与反义链的序列，合理选择测序方向或dNTP的加入顺序，有助于准确直观地测定基因型并判断结果。