HPLC法测定不同产地灯盏细辛中灯盏乙素的含量

作者：刘鹏，周军，秦向阳，王巧峰，李晓晔 【关键词】 ,灯盏乙素

Determination of scutellarin in Erigeron breviscapus from different places by HPLC

【Abstract】 AIM: To develop a HPLC method to determinate the proportion of scutellarin in Erigeron breviscapus from different places of production. METHODS: The analytical column was a ZODBAXC18 （4.6 mm×150 mm） filled with a 5 μm stationary phase. The mobile phase consisted of methanol(0.02 mol/L) phosphate buffer solution ［pH 5.2 (35∶65)］. The flowrate was 0.8 mL/min. The injection volume was 20 μL. The Detector was set at 335 nm. The column temperature was 25℃. RESULTS: The calibration curve was linear over the range of 0.74-3.70 μg (r=0.999 6). The average recovery of the method was 97.24%, RSD 0.82% (n=6). CONCLUSION: The proposed method would be used in quantitative analysis of scutellarin in Erigeron breviscapus. The method is convenient, economical and accurate with good reproducibility.

【Keywords】 scutellarin; HPLC; Erigeron breviscapus

【摘要】 目的：建立测定不同产地灯盏细辛中灯盏乙素含量的方法. 方法：采用高效液相色谱法，以ZODBAXC18 (4.6 mm×150 mm，5 μm)为色谱柱，流动相为甲醇-0.02 mol/L，磷酸缓冲液pH为5.2（35∶65），检测波长为335 nm，流速0.8 mL/min，柱温25℃，以外标法测定灯盏细辛中灯盏乙素含量. 结果：灯盏乙素在0.74~3.70 μg范围内与峰面积呈良好线性关系，r=0.999 6，灯盏乙素平均加样回收率为97.24％，RSD为0.82％（n=6）. 结论：本方法可靠性高，准确性和重现性好，适用于灯盏细辛中灯盏乙素的含量测定.

【关键词】 灯盏乙素；高效液相色谱法；灯盏细辛

0引言

灯盏细辛为菊科植物短葶飞蓬［Erigeron breviscapus (Vant.) Hard.Mazz］的干燥全草. 主要分布于我国云南、贵州、广西、四川等地，是一种民间常用中药. 该药具有散寒解表、祛风除湿、活血化瘀、通经活络等功效. 临床主要用于治疗缺血性脑血管疾病、冠心病、心绞痛等症，其疗效较好，毒副作用小，运用范围广［1］. 灯盏细辛主要有效成分为黄酮类化合物灯盏乙素［2-3］，由于不同产地的灯盏花药材主成分含量差异较大，为了控制药材质量，本研究参考文献［4,5］的方法，建立了以灯盏花有效部位为基础的高效液相色谱指纹图定性定量分析方法，确定了控制灯盏花药材质量的指纹峰，为快速简便地鉴定不同来源的灯盏花药材质量提供了参考标准，并为扩大灯盏细辛资源的应用提供可靠的科学依据.

1材料和方法

1.1材料Agilent1100高效液相色谱仪：Agilent1100系列四元梯度泵、Agilent1100系列UAD检测器、Agilent1100化学工作站（美国Agilent公司）；BACKMAN DU640紫外分光光度计；SK250LH型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）. 灯盏乙素对照品（中国药品生物品检定所，批号0842200102，纯度98.0％）；灯盏细辛样品来源于云南、贵州、广西和四川等地，并经第四军医大学药物研究所王四旺主任药师鉴定；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯.

1.2方法

1.2.1色谱分析条件ZODBAXC18分析柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相：甲醇0.02 mol/L磷酸盐缓冲液pH为5.2（35∶65），检测波长335 nm，流速0.8 mL/min，柱温25℃. 定量方法：外标法；理论塔板数以灯盏乙素计算，应不低于5000.

1.2.2供试品溶液和对照品溶液的制备取不同产地灯盏细辛生药研磨后的粉末约5 g，精密称定，以700 mL/L的乙醇50 mL浸泡30 min后加热回流2 h，滤过，药渣再加700 mL/L的乙醇50 mL回流2 h，滤过，合并滤液，减压浓缩成浸膏样，加沸水50 mL溶解，用乙酸乙酯萃取3次，每次20 mL，分取、合并水层. 水层减压浓缩至干，残渣用流动相溶解并稀释至25 mL容量瓶中，摇匀，再准确吸取该溶液1 mL于10 mL容量瓶中,用流动相稀释至刻度，以0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液备用.精密称取灯盏乙素对照品适量，用流动相溶解，制成370 mg/L灯盏乙素对照品溶液，以0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液备用.

1.2.3线性关系考察精密吸取灯盏乙素对照品溶液(370 mg/L) 0.5，1，1.5，2，2.5 mL分别置于5 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，分别吸取各对照品溶液20 μL进样，按上述色谱条件测定峰面积.

1.2.4稳定性试验取灯盏乙素对照品溶液，分别在0，1，5，10，24和48 h依次进样20 μL，测定灯盏乙素含量.

1.2.5精密度试验精密吸取370 mg/L灯盏乙素对照品溶液20 μL，重复进样6次，测定峰面积，计算精密度.

1.2.6重现性试验取1号灯盏细辛样品6份，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定含量.

1.2.7加样回收率试验精密称量6份已知含量（1号样品，灯盏乙素含量为7.13 mg/g）的灯盏细辛样品70 mg，分别准确加入灯盏乙素对照品(370，740，1110 mg/L) 1 mL，按样品测定法，测定灯盏乙素含量，计算加样回收率.

2结果

2.1线性关系线性关系的考察中测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，回归方程Y=-27.34＋3876.04X，r=0.999 6 (n=6). 结果表明灯盏乙素在0.74~3.70 μg范围里呈良好线性关系.

2.2灯盏乙素稳定性稳定性试验中，6次所测灯盏乙素峰面积RSD为1.03％，灯盏乙素在流动相溶液中48 h内稳定. 精密度试验中，6次测量峰面积的精密度RSD为0.98％. 重现性试验中，测得灯盏乙素的RSD为0.94％（n=6），表明此法重现性良好. 加样回收率试验中，测定的平均加样回收率为97.24％，RSD为0.82％（n=6）（表1）.

2.3样品测定结果对不同产地灯盏细辛样品进行测定，分别精密吸取对照品与各供试品溶液20 μL，注入高效液相色谱仪，依上述色谱条件，依外标法计算含量，测得样品中灯盏乙素的含量. 四批样品结果见表2. 灯盏细辛生药样品色谱图见图1.

表1加样回收率试验结果（略）

表2样品测定结果（略）

A: 灯盏乙素对照品; B: 灯盏细辛生药样品.

图1灯盏乙素对照品与灯盏细辛生药样品色谱图（略）

3讨论

3.1流动相选择文献［4,5］采用磷酸盐缓冲液、甲醇水磷酸为流动相，其问题是灯盏乙素主峰与其他峰分离度不好，达不到有效分离. 我们改进流动性配比，选择甲醇0.02 mol/L磷酸缓冲液（pH为5.2）（35∶65）为流动相，此流动相能排除干扰，适宜灯盏乙素主峰与其他峰明显分离.

3.2测定波长选定通过对灯盏乙素对照品在波长200~700 nm之间进行紫外吸收扫描，表明灯盏乙素在215 nm，284 nm，335 nm波长处有最大吸收，其中在335 nm处有最大值，故选择335 nm为灯盏乙素检测波长.

3.3提取条件选择我们参考文献［4］报道的提取条件，考察了提取溶剂浓度对灯盏乙素含量的影响，分别用600，700，800和900 mL/L的乙醇溶液进行提取试验，结果表明，700 mL/L的乙醇溶液提取率最高，故采用700 mL/L乙醇为提取液，加热回流提取2次，每次2 h，得到满意提取效果.

总之，本研究改进的方法操作简便、快速、灵敏、准确，经对不同产地的灯盏细辛中灯盏乙素含量测定，能达到有效分离各组分的目的，表明此法可作为灯盏乙素的定量测定方法，为灯盏乙素的质量控制奠定了基础；同时表明不同地域的灯盏细辛中灯盏乙素含量有明显差别，说明生态环境、采收时间和储存条件等可能对灯盏乙素的含量产生影响.

【参考文献】

［1］ 宋立人，洪恂，丁绪亮，等. 现代中药学大辞典［M］.北京:人民卫生出版社，2001: 885-887.

［2］ 张卫东，陈万生，孔德生，等. 中药灯盏细辛化学成分的研究［J］. 第二军医大学学报, 2000, 21(2): 143-145.

［3］ 郭济贤，潘伟坚，杨瑞萍，等. 中药灯盏花及其同属部分植物的研究概况［J］. 中成药研究, 1987, 9(8): 30-31.

［4］ 李延钊，刘文庸，李国栋，等. 灯盏细辛提取工艺的研究［J］. 中国医药工业杂志，2002,33(6):281-282.

［5］ 张旭，耿伯显，陈玲玲，等. 灯盏花HPLC指纹图谱的研究［J］. 中国医药工业杂志，2003,34(6):270-272.