益生菌作用机制及筛选方法研究进展

摘要简述益生菌制剂的发展历程、作用机制、筛选方法，分析存在的问题和今后的发展方向，以为水产健康养殖提供参考。

关键词益生菌制剂；作用机制；筛选方法

中图分类号Q939.97文献标识码A文章编号 1007-5739（2011）22-0052-03

ProgressResearchonMechanismofActionandSelectionMethods inProbiotics

FENG Fan 1JIANG Qi-huan 1ZENG Kai 1FAN Xuan-jiao 1HU Wang 2YE Ying-wang 1JIANG He 2 *

（1 College of Food and Biological Engineering，HeFei University of Technology，Hefei Anhui 230009； 2 Aquatic Product Research Institute，Anhui Academy of Agricultural Sciences）

AbstractDeveloping history，mechanism of action and selection methods were summarized in the paper.The existing deficiency and the developing direction were proposed so as to provide references for health aquaculture.

Keywordsprobiotics；mechanism of action；selection methods

近年来，我国水产品出口因抗生素等药物残留问题屡受挫折，经济损失巨大。2006年，我国水产品又接连在港台和大陆等国内市场遭遇抗生素和孔雀石绿残留影响，给水产品质量安全蒙上阴影。这些药物残留主要来自水产病害控制中使用的抗生素及饲料中添加的药物，而水产病害随着养殖密度的不断提高和集约化养殖的发展越来越严重，与此相应，滥用水产药物的现象十分普遍，导致水产品中药物残留严重。抗生素残留是阻碍水产品出口创汇和引起国内消费者担心水产品质量安全的主要因素，从而导致欧盟全面对中国动物源性产品的进口禁令，损失6亿多美元。2006年在销往台湾的大闸蟹中检出可疑致癌物硝基呋喃类代谢物，同年，在多宝鱼中也检出上述残留物，还查出环丙沙星、氯霉素、红霉素等禁用抗生素残留，从而引发国内消费者对水产品质量安全的信任危机。毫无疑问，影响水产品质量安全的抗生素残留已严重阻碍水产业的持续健康发展，成为行业亟待解决的重大关键问题。

益生菌制剂又称微生态制剂、生态制品、活菌制剂，是指一类通过添加到食品或饲料中能够起到调节肠道微生态菌群结构，从而对人或动物产生有利影响的微生物。益生菌主要来源于动物肠道正常生理性细菌和非肠道菌。众多研究表明，水产动物肠道菌群主要是由鱼吞咽水与进食时所带入，进入体内的各种菌种相互作用竞争，最后达到微生态平衡，从而形成水产动物体肠道内的正常菌群，提高养殖动物对疾病的抵抗力。

1益生菌发展简史

益生菌的研究是一门新兴的学科，而水产益生菌利用的研究则更加短暂（表1）。

2研究现状

2.1益生菌种类

历史上第一个被发现的益生菌是乳酸菌，之后研究人员又相继发现其他益生菌[8-9]（表2）。

2.2益生菌在水产养殖中的作用机制

目前，人们对益生菌的研究还不够深入，对其作用机制更是知之甚少，主要是由于人或动物肠道内微生态环境非常复杂，有近400种菌群表现栖生、互生、偏生、竞争或吞噬等关系。如今普遍认为益生菌的作用机制是通过调控宿主体内微生物群落的平衡，增殖有益细菌，抑制有害细菌，从而使前者成为优势菌群使宿主受益[10]。下面是6种当前主流的作用机理以及一些近期提出的作用机制，而且一般益生菌都只符合其中的几个作用机制[11]。

2.2.1 竞争附着位点。据报道，病原菌黏附在水产动物表皮和肠道上皮黏膜的能力与其对宿主的毒性有关[12]，并且是细菌感染的第一步[13]，同时益生菌只有较长时间定植才能够显示潜在的益处。因此，黏附能力是筛选益生菌的重要指标之一，而竞争附着位点也成为抑制病原菌的第一道防线。Olsson等[14]从大菱鲆和欧洲黄盖鲽的肠道和表皮分离出11株菌，发现其在肠道黏液中比鳗弧菌具有更强的黏附和生长能力，证实这几株菌能有效地同病原菌竞争肠黏膜上的附着位点。

但有关鱼苗的益生菌定植信息仍较少，且由于在幼鱼成长过程中黏附位点可能会发生变化以及肠道内化学组成的改变。因此，并不能确定从成鱼体内分离出的黏液是否能代表幼鱼体内菌种的黏附特性[15]。

2.2.2 产生抑菌物质。益生菌会分泌多种具有杀菌或抑菌作用的化学物质（如有机酸、超氧化物歧化酶、过氧化氢、溶菌酶、细菌素等），影响病原菌的定植和生长，反过来这些物质又影响宿主和病原菌对化学物质和能量的竞争，以此来调节宿主体内微生态平衡[16]。许多从水产养殖环境中分离的细菌在体外可抑制某些水产动物中出现的病原菌，但至今仍无法证实其在体内条件下也可产生这些抑菌物质[17]。因为环境会影响同一菌株的抑菌能力，所以不能通过体外的抑菌作用来预测其在体内的活力。尽管如此，体外拮抗作用仍然是筛选益生菌的一个指标，用于体外检测该菌是否对目标病原菌具有拮抗作用。

2.2.3 竞争化学、营养物质及可利用能源。营养素和可利用能源的竞争很大程度上决定宿主肠道内微生物菌群的组成情况。当环境中营养素有限时，益生菌与病原菌会争夺营养，从而抑制病原菌的生长繁殖。Verschuere L等[7]报道具有含铁细胞的益生菌和病原性依赖于含铁细胞的病原菌竞争铁离子，从而抑制后者活性。

2.2.4作为营养作用。一些研究表明，水产动物中的微生物菌群有助于宿主的消化吸收。以鱼为例，据报道，类杆菌属（Bacteroides）和梭状芽孢杆菌（Clostridium）能够为宿主提供脂肪酸和维生素等营养物质[18]。而一些微生物如农杆菌、假单胞菌、葡萄球菌、短藻等都有助于北极红点鲑鱼对营养的吸收[19]。另外，一些细菌可以产生胞外酶制剂，如蛋白酶、脂肪酶，以及必要的生长因子并以此参与贝壳类的消化过程[20]。

2.2.5 净化水质。益生菌能够有效改善水产养殖池塘的水质，所涉及的微生物类群有光合细菌、硝化细菌和以芽孢杆菌为主的复合微生物，主要通过生物拮抗作用、生物絮凝作用、利用有机酸、氨、硫化氢等的光合作用，以及硝化和反硝化作用和铁、汞等有毒物质的转化作用。李卓佳等[21]将芽孢杆菌投入虾池，一段时间后，其能够显著抑制弧菌类群生长繁殖，有效预防虾病，同时可以促进底泥异养细菌生长繁殖，利于虾池自我净化，另外其还能促进浮游微藻平稳繁殖，有助于营造虾池良性生态循环。

2.2.6增强免疫反应。增加动物免疫力是益生菌的重要作用，也是其代替抗生素的一个重要原因。益生菌可以刺激免疫器官发育，提高抗干扰素和巨噬细胞活性，并可以作为非特异性免疫调节因子，激发宿主免疫反应，从而增强机体免疫功能。杜远明等[22]分离节杆菌和乳杆菌投喂鲢鱼，结果发现实验组白细胞吞噬率、吞噬指数、巨噬细胞吞噬率、成活率、特异性抗体效价均高于对照组。Rengpipat等[23]将芽孢杆菌S11喂养斑节对虾，发现其可以有效增加吞噬能力，并且激活酚氧化酶和抗菌活性，表明S11可利用免疫反应和益生菌竞争排斥来防御病原菌。

2.2.7其他。①干扰群体感应。群体感应（quorum sensing，QS）是细菌细胞与细胞之间信息交流的过程，在许多病原菌中发现群体感应的信号分子AHL和AI-2，群体感应系统调控微生物的多种生理生化功能，如生物膜形成和致病基因表达等，因而阻断群体感应是抑制病原菌的一种新的方法[24]。Manefield M等[25]从海洋红藻（Delisa pulchra）中提取一种AHL类似物卤化呋喃，有望成为群体感应的阻断剂，这类化合物如添加适量，可有效抑制弧菌属病原菌。②抗病毒活性。一些益生菌具有抗病毒活性。尽管其作用机制仍不清楚，但实验室研究指出，病毒失活可能是由化学或生物物质引起，如藻类的提取物或细菌的胞外酶等。据报道，从鲑鱼属鱼卵中分离出的假单胞菌、藻弧菌、气单胞菌和棒状杆菌对传染性造血器官坏死病毒（IHNV）具有抑制作用[26]。③溶藻作用。益生菌对许多种微藻都有一种重要的溶藻作用，尤其对引起赤潮的微藻更加有效[27]。然而益生菌抑制藻类生长的这种性质对育苗技术是不利的，因为育苗时需要向培育池中添加单细胞藻类，但是如果在培育池中出现不良的藻类时，就可以借助于此性质将其清除。

2.3益生菌筛选研究进展

2.3.1获取背景信息及假定菌种范围。在开始对益生菌发展历程的研究之前，需要考虑培养的可行性和经济性。只有对某种益生菌在水产养殖中的作用效果有所了解，才能决定该种益生菌是否可以应用于水产养殖。筛选获得大量候选益生菌种是一项繁重而艰巨的任务。体内筛选和体外环境筛选均可，并没有明确的迹象显示从宿主动物体内或者其周围环境中分离出来的假定益生菌要比从野生种群或者位于不同栖息地的宿主动物中分离出的益生菌表现的更好[8]。

2.3.2获得假定益生菌菌种。筛选益生菌种的一种普遍方法是体外抗性测试。在测试中，由于固体或液体介质中的病原体暴露在候选益生菌种或其胞外产物下，可根据抑制性化合物，如细菌素、铁载体的产量或者对营养成分的竞争来选择益生菌种[28]。

2.3.3安全性评估和残留量检测。益生菌对宿主动物不应有致病性，这一点应该在使用益生菌种之前得到确认。因此，宿主动物需在有外压和无外压2种条件下进行测试。当筛选菌种的时候，需要考虑益生菌种和藻类的相互作用。对益生菌安全和效果评价时，需考虑他们经过宿主动物胃肠道时的残留量（例如对胆盐的抵抗性，低pH值和蛋白酶的抗性）[29]。益生菌种群应有效附着在小肠绒毛上皮细胞上，进而减少致病病原菌的定植和大量繁殖。

2.3.4活体中评测。候选益生菌种的作用还需要在活体中得到检测，包括向培养下的宿主动物体内引入候选菌种，并监测生长状况、种群分布、残留量和各种理化指标[30]。然而当需要微生物控制的时候，具有代表性的活体体内的测试看起来是评价益生菌对宿主动物的潜在影响的有效工具。另外，可能的益生菌必须对宿主动物有有益作用（如加强营养和增加免疫响应）。最后，益生菌种必须可以在平常储存条件下稳定生长，并且在技术层面上可用于工业生产（如冻干技术）。

2.3.5饲养条件下的作用。以上的测试标准对于选择益生菌种有重要作用，但是要确认其为有益菌种，饲养试验是必不可少的。对于宿主动物经益生菌培养效果的实际测评需要长期的观察与调查[31]。

3益生菌存在的问题及发展方向

3.1益生菌存在的主要问题

尽管众多研究已表明，益生菌在水产养殖中对水质的改善和保护水产动物免受病原菌侵害方面都有显著效果，但仍然存在诸多问题，如菌种不稳定、微生物受外界环境影响较大、对突发流行病效果不明显、菌体在体内定植机理尚未阐明、作用机制仍不十分明确。Atlas [32]认为由于因果关系仍不明确，不能被科学系统的论证，所以益生菌的使用仍存在争议，还不被科学界认可。由此可见，研究作用机制的重要性，因为任何长期的商业应用都必须考虑到对环境等各方面的影响，如添加益生菌是否会永久改变微生物菌群或会影响该区域内有机和无机化合物的转变。据报道，某些芽孢杆菌和假单胞菌的抗菌效应是由于它们产生的抗生素引起的，而这显然并不符合人们减少使用抗生素的初衷[8]。另外，增加对益生菌机理的认识也有助于更加高效地筛选益生菌。如今阻碍益生菌作用机制进一步深入研究的最大障碍是体内与体外的差异，而这种差异可能会导致众多体外的试验结果并不符合生物体内的实际情况。

3.2益生菌制剂的发展方向

针对上述问题，可以总结出以下发展方向。首先，进一步研究益生菌的作用机制及其在体内定植机理研究是重中之重，有利于益生菌制剂在实际生产中的指导和应用；其次，开发新型菌种，如耐酸、耐盐、耐高温等的菌种，提高益生菌产品稳定性，增加养殖过程中的可选择性；最后，加强应用方面的研究，如长时间保持菌种活性、改进菌种搭配，提高复合型生态制剂的作用效果以及菌种使用条件，进一步提升利用效果。尽管益生菌存在一些缺点，但相对其他抗病途径而言，因其绿色、环保、安全的特性，仍是抗生素首选的替代品。

随着水产养殖业进一步发展，以及人们对食品质量要求的提高和环境保护意识的增强，益生菌将成为万众期待的新生物。在不久的将来，将有越来越多的人加入到益生菌的研究中，突破益生菌的应用瓶颈，解决或减轻益生菌自身带来的问题，使其真正能够在水产养殖业中发挥作用。

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