三七总皂苷对糖尿病大鼠肾皮质p22phoxmRNA表达的影响

糖尿病肾病(DN)的发病机制尚不完全清楚，目前已知氧化应激反应增强、活性氧(ROS)产生增多在糖尿病肾病的发生发展中发挥了重要的作用。最近，NAD(P)H氧化酶因参与氧化应激过程而受到关注，P22phox是NAD(P)H氧化酶的一个必需亚单位，在维持其活性中起重要作用。临床研究表明中药三七对DN有着良好的疗效，本实验通过观察三七总皂苷(PNS)对糖尿病大鼠肾皮质p22phox mRNA表达的影响及其对肾脏的保护作用，以探讨三七总皂苷防治DN的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物：SD清洁级3月龄大鼠35只，雄性，体重150～200g，浙江省医学科学院实验动物中心提供。大鼠饲养于清洁级动物室，室温21～25℃。

1.2 试剂：链脲佐菌素(STZ)、氨基胍(AG)为美国Sigma公司产品；血栓通胶囊(每粒含三七总皂苷100mg)为黑龙江珍宝岛制药有限公司产品；血糖测定试剂盒由上海丰汇医学科技有限公司提供；尿蛋白定量测定试剂盒由南京建成生物工程公司提供；总RNA抽提试剂Trizol、逆转录酶试剂盒、Taq DNA聚合酶由上海生工生物工程技术服务有限公司提供；DNA梯度Marker由Takara公司提供。

1.3 引物：搜索GenBank数据库大鼠p22phox mRNA序列，利用Primer Premier引物设计与分析软件设计p22phox及内参GAPDH引物，委托上海生工生物工程公司合成，序列如下：p22phox引物：上游：5’-GACGCTTCACGCAGTGGTACT-3’，下游：5’-CACGACCTCATCTGTCACTGG-3’，目标长度：485bp；GAPDH引物：上游：5’-GTCGGTGTGAACGGATTT-3’，下游：5’-ACTCCACGACGTACTCAGC-3’，目标长度：276bp。

1.4 方法与步骤：分述如下。

1.4.1 造模、分组及治疗：适应性饲养大鼠1周。造模前将所有大鼠随机分为正常对照组(NC组，6只)和造模组(29只)。STZ临用前用0.1mol／L无菌枸橼酸钠缓冲液(pH4.4)配成2％的溶液，放于冰浴中。糖尿病造模组大鼠禁食不禁水14小时，将STZ以65mg／kg一次性于大鼠左下腹腔注射造模，两小时后给大鼠进食。正常对照组按相同的方法和剂量注射枸橼酸钠溶液。72h后至少连续3天尾静脉检测血糖(Glucose Glu)。以连续3次血糖>16.65mmol／L，尿量>原尿量的150％，饮水明显增多者为大鼠糖尿病成模标准［1，2］。造模后选取符合成模标准，状态稳定的糖尿病大鼠(24只)，随机分为糖尿病模型组(DM组，8只)，三七总皂苷组(PNS组，8只)和氨基胍组(AG组，8只，在实验过程中死掉1只)，并予药物进行干预。其中，PNS组给予三七总皂苷100mg・kg-1・d-1灌胃，AG组给予氨基胍100mg・kg-1・d-1灌胃，DM组及NC组给予生理盐水1ml・100g-1・d-1灌胃。共8周。

1.4.2 标本收集与处理：用药后8周末于处死大鼠前一天，用代谢笼收集大鼠24h尿标本，记录尿量后取5ml保存于-30℃冰箱中；大鼠称重后，从股静脉采血，分离血清待测；随后处死大鼠，取双肾，去掉肾包膜称重，右肾用10％中尔马林溶液固定，行PAS染色，左肾液氮冷冻，-70℃冰箱冻存，提取RNA。

1.4.3 指标检测：采用日立-7020型全自动生化分析仪检测血糖，用考马斯亮兰法检测尿蛋白，并计算24小时尿蛋白定量。

1.4.4 肾组织病理学检查及肾小球细胞外基质的检测：取适量右肾组织行石蜡包埋，制成厚度为3 μm切片，行PAS染色，光镜下观察大鼠肾脏病理变化。用北京航空航天大学全自动图像分析系统对PAS染色切片进行分析，每张切片按顺时针方向随机取10个完整正切肾小球，经分析系统计算每个肾小球PAS阳性染色面积与整个肾小球面积之比值，然后求10个肾小球此比值的均数，即为每张切片肾小球细胞外基质(ECM)的相对含量［3］。

1.4.5 肾皮质p22phox mRNA的检测：分别取各组大鼠肾皮质100mg，按Trizol试剂说明书操作，提取总RNA，所得RNA用紫外分光光度计测260nm／280nm处的紫外吸收值(OD值)，每个样品重复测3次。结果：所提取的RNA，A260/280比值约在1.8～2.0。将所提取的总RNA经1％的琼脂糖凝胶电泳显示5s、18s和28s三条带，证实RNA无降解。

取5μg RNA样品，1μl Oligo(dT)18加入一无RNA酶的200μl薄壁PCR管中，用灭活DEPC水补足至10μl，混匀。65℃加热10min，迅速冰水浴5min，短暂离心。按下列顺序加入：5×Buffer 4μ，dNTP(10mM)1μl，RNA酶抑制剂0.5μl，M-MLV逆转录酶(200U／μl)0.8μl，DEPC水最终补足至20μl混匀，42℃保温60min，95℃加热5min，立即冰水浴冷却5min，短暂离心。反应产物-20℃冻存。

取上述逆转录反应产物10μl行反转录聚核酶链反应(PCR)，按下列步骤操作(30μl反应体系)：cDNA10μl，10×Buffer 2.5μl，MgCl2(25Mm)2μl，dNTP(10mM)0.5μl，p22phox引物正、负引物各0.5μl，DEPC-H2O 13.8μl，TaqDNA酶0.2μl。将上述各成分混匀，先95℃变性10min，然后94℃变性1min，65℃退火1min，72℃延伸1.5min，进行30个循环扩增，72℃延伸10min。PCR产物-20℃冻存。

GAPDH的PCR扩增按下列步骤操作(30μl反应体系)：cDNA3μl，10×Buffer3μl，MgCl2(25Mm)1.8μl，dNTP(10mM)0.6μl，GAPDH引物正、负引物各0.5μl，DEPC-H2O 21.1μl，TaqDNA酶0.5μl。将上述各成分混匀，先94℃变性3min，然后94℃变性50秒，56℃退火40秒，72℃延伸1min，进行28个循环扩增，72℃延伸7min。PCR产物-20℃冻存。

取8μl PCR产物与2μl上样液混合，以2％琼脂糖(含溴化乙锭0.5g／ml)，在1×TAE缓冲液中，电压80V的条件下电泳，电泳结果在紫外灯下观察，以GAPDH为内参照，用凝胶扫描成像系统对产物进行半定量分析，结果以p22phox与对应的GAPDH密度积分比值表示p22phox mRNA相对表达量。

1.5 统计学处理：所有数据均以均数±标准差表示，样本均数组间的比较用One-Way ANOVA(单因素方差分析)方法，方差齐性用Student-Newman-Keuls检验，方差不齐用Tamhane’s T2检验。P

2 结果

2.1 各组大鼠体重、血糖、24小时尿蛋白定量的比较：见表1。

DM大鼠均出现多饮、多食、多尿、消瘦等症状。与NC组比较，DM组、PNS组、AG组体重明显偏轻（P0.05)；与NC组比较，DM组、PNS组、AG组血糖明显升高（P0.05)；DM组24 h尿蛋白定量与NC组相比有明显增高（P0.05)。提示PNS与AG均不能延缓糖尿病大鼠消瘦的进程，均不能降低糖尿病大鼠的血糖，糖尿病大鼠在持续高血糖状态8周后，24 h尿蛋白定量较正常大鼠升高，PNS与AG能减少糖尿病大鼠24 h尿蛋白定量至正常水平，其作用效果相似。

2.2 各组大鼠肾组织病理变化比较：见图1。

肾脏病理显示DM组大鼠肾小球基底膜节段性轻中度增厚，系膜细胞及系膜基质呈节段性轻中度增多，肾小囊未见粘连，肾小管及肾间质未见明显病变，小血管壁轻度增厚；PNS组与AG组大鼠仅见肾小球基底膜轻度增厚，系膜细胞及系膜基质轻度增多；NC组大鼠肾脏病理无明显糖尿病性改变。

DM组肾小球ECM相对含量为(10.65±1.06)％，较NC组(5.42±0.5)％明显升高（P

提示实验结束时糖尿病大鼠的肾脏受到了明显的损害，FNS与AG对糖尿病大鼠的肾损害有保护作用。

2.3 各组大鼠肾皮质p22phox mRNA的比较：见图2、图3。

DM组p22phox mRNA相对表达量较NC组明显增加(P

提示糖尿病大鼠肾皮质p22phox表达较正常大鼠升高，PNS能减少p22phox的表达。

3 讨论

采用由Junod［4］创建的经典的STZ糖尿病大鼠模型制作方案，可以迅速建立DM模型。本实验采用STZ一次性大剂量腹腔注射SD大鼠，血糖明显增高，成功造模成糖尿病大鼠。8周后本实验结束，糖尿病大鼠血糖与正常大鼠比较仍有明显的升高，提示造模后的大鼠一直持续在高糖状态。糖尿病大鼠的肾脏明显较正常大鼠肥大，24小时尿蛋白定量亦显著升高，肾脏病理显示糖尿病组大鼠有较明显的肾损害。这与Sainik S［5］的结果相一致。

近年来较多的研究认为，氧化应激(OS)是糖尿病及其并发症的重要发病机制之一。高糖可通过多种途径致肾组织中反应性氧化产物(ROS)增多，ROS可通过刺激TGF-β1、血管紧张素Ⅱ、糖基化终产物(AGEs)的过度表达和产生、激活蛋白激酶C(PKC)和丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)、介导AGEs激活核转录因子κΒ(NF-κΒ)、PKC-BI以及介导AGEs刺激TGF-β1的转录等作用而参与糖尿病肾病ECM聚积和发展［6］。

在ROS中，超氧阴离子（O2-）是最主要的组分，而肾脏NAD(P)H氧化酶是O2-产生的最主要调控酶之一［7］。因此NAD(P)H氧化酶是调控ROS产生主要来源之一，是防治DN的一个重要靶点。NAD(P)H氧化酶是细胞膜上一类特殊的电子传递链复合物，主要由膜表面细胞色素b588和结合在b588上3种细胞质内游离黄素蛋白组成。细胞色素b588由一条重链和一条轻链两亚基组成，其中重链为9lKD糖蛋白(gp91-phox)，轻链为22KD多肽(p22-phox)，前者是NAD(P)H氧化酶的核心部分，后者则与酶的活性密切相关［8-9］。NAD(P)H氧化酶激活后，整个电子的转运均在细胞色素内完成，胞质因子通过与p22phox亚单位结合，激活细胞色素b588并将电子从NADH／NADPH运输到血管内或细胞外的氧原子，从而形成超氧阴离子（O2-)及其衍生物。因此p22phox亚单位在维持氧化酶的正常功能及产生O2-中起着重要作用。NAD(P)H氧化酶由于所含有的成份较复杂，要整体检测需要精细的实验设备，而p22phox亚单位在氧化应激中的重要作用，其在体内的表达可以间接地说明NAD(P)H氧化酶的氧化活性。Etoh T等［10］发现在链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病鼠肾脏中p22phox表达上调，而NAD(P)H依赖的活性氧(ROS)产生过多，引起糖尿病鼠肾脏组织的DNA损伤，促进糖尿病肾病的发展。本实验结果也显示糖尿病大鼠肾皮质p22phox mRNA较正常大鼠明显上调，提示存在着氧化应激状态。

三七为五加科植物人参三七的干燥根，其性温，味甘、微苦，具有“化瘀止血，消肿定痛”的功能。三七主要成分为三七总皂苷（PNS），具有较强的抗氧化自由基损伤和抗脂质过氧化损伤作用。已有的动物实验表明PNS能减轻心、肝、脑等组织的氧化应激［11-12］，王雪梅等［13］用分光光度法直接检测活性氧自由基，发现三七皂苷能有效地清除OH-和O2-。其作用机制可能在于其一方面减少氧自由基的产生，另一方面抑制氧自由基以降低脂质过氧化物，从而发挥抗脂质过氧化损伤的作用。在本研究中，糖尿病大鼠用PNS及AG干预后，其血糖没有明显下降，而肾脏病理及24小时尿蛋白都较糖尿病大鼠都有显著性差异，且两者作用效果相似，提示PNS及AG对糖尿病大鼠没有明显的降糖作用，对糖尿病大鼠的肾损害则具有明显的保护作用，且这种保护作用不依赖于降低血糖而发挥作用。氨基胍是AGEs的抑制剂，在本实验中显示AG组大鼠肾皮质p22phox mRNA与DM组大鼠比较没有明显的差异，氨基胍对糖尿病大鼠肾脏的保护作用可能通过抑制AGEs的形成来实现。而PNS组大鼠肾皮质p22phox mRNA与DM组大鼠比较则明显降低，提示PNS对糖尿病大鼠肾脏的保护作用是通过抑制NAD(P)H氧化酶激活，从而抑制氧自由基的产生而发挥作用。

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收稿日期 2008-01-23