倍性育种在林木遗传育种中的研究进展

摘要 从花药培养和多倍体育种两方面对林木倍性育种研究进展进行了综述，主要介绍了花药培养的主要作用、现状、影响林木花药培养的主要因素和林木多倍体育种的发展现状、作用、途径及方法；提出了倍性育种在林木育种中遇到的问题，而随着人类对其应用价值认识的提高以及有关新技术方法的注入，建立在现代遗传学以及细胞染色体工程技术基础之上的林木倍性育种将焕发出新的生机与活力。

关键词 花药培养；多倍体；林木遗传育种；研究进展

中图分类号 S722.3+5 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）10-0120-03

林木的生长周期较长，常规育种年限也将会持续很长时间，并且在自然状态下林木个体多呈现杂合性，因此利用常规育种已不能满足林木遗传育种的目标。倍性育种是通过改变染色体数量，产生不同变异个体，进而选择优良变异个体培育新品种的育种方法，它将会显著地缩短育种年限，提高育种效率，增强林木抗逆性，提高木材产质量等，为我们展示了日益广阔的发展前景。截至目前，通过花药培养法获得6科7属40余个种的单倍体植株[1]，为充分利用杂种优势，培育产量高、抗性强而生长快的优良品种，展示了广阔的前景[2]。在杨属中，花粉愈伤组织诱导率、分化率可分别达到30%以上、80%以上[3]。1935年，在瑞典发现了一株叶片巨大、生长迅速的巨型三倍体欧洲山[4-5]，成为了林木多倍体育种的开端。近年来，杨树、橡胶、桑树等一系列林木多倍体新品种的选育成功[6-8]，为人类展示了越来越大的发展空间。

1 林木花药培养

1.1 林木花药培养作用

利用毛蔓陀罗花药培养[9]获得单倍体植株，开创了利用花药培养获得单倍体及纯合体的先河。林木花药培养始于1974年，佐藤亨利用杨树花药培养获得了再生植株，但最终并未获得单倍体植株。王敬驹等[10]最先通过花药培养获得了单倍体黑杨。如今，花药培养已经在杨树、橡胶树、泡桐、柑橘等树种中有所研究[11-14]。林木花药培养的主要作用是：通过单倍体育种，获得纯合育种材料，以缩短育种年限；利用纯合二倍体材料研究林木遗传变异规律，减少育种的盲目性；克服远缘杂种的不育性，获得具有双亲优良特性的可育远缘杂种；利用在远缘杂交F1代的花药培养中出现的混倍体和丰富的染色体变异材料进行林木细胞遗传学等基础性研究。另外，可通过花药培养建立双单倍体群体。

1.2 影响林木花药培养的主要因素

1.2.1 林木材料基因型。供体植株的基因型是影响花药培养的关键，不同基因型植株花药的培养力存在差异，有些材料对某些培养基根本没有反应。花药培养的诱导率与杂种优势有关，通常杂种比纯种容易诱导。钱春艳等研究表明，枸杞花药培养对基因型有很大的依赖性，宁杞1号是较容易培养的基因型[15]。花药培养力的大小受到多基因控制[16]，因而随着基因型的差异有很大变化。

1.2.2 培养方式。一般采用固体培养基进行花药培养。但是朱湘渝等[17]对杨树花药进行培养时发现，液体培养优于固体培养。诱导花药分化也需要适宜的光照和温度。李成浩等[18]在对影响小黑杨花药培养中花粉愈伤组织诱导的生理因素进行研究时发现，25 ℃和暗培养条件下花粉愈伤组织诱导率最高，达到了89.2%。

1.2.3 培养基成分。花药培养技术的重要环节之一就是选择合适的基本培养基。曹晓燕在对毛刺槐花药培养进行研究时发现，在培养基中单独加BA无法诱导愈伤组织的形成，还发现BA+2，4-D诱导效果比BA+NAA好，说明2，4-D在毛刺槐花药愈伤组织形成过程中起着非常重要的作用[19]。段丽君等[20]在诱导枸杞花药愈伤组织时得出，2，4-D与KT组合的培养基上愈伤组织的诱导率最高。顾淑荣等[21]对枸杞进行花药培养发现，培养基中不加蔗糖，花药中没有胚状体产生，当蔗糖浓度在15%时效果最好。

1.2.4 预处理。对接种的花药进行预处理，可提高诱导率。预处理方法主要有3种：一是离心。杨一平等[22]研究认为2 000 r/min效果最好，离心处理对花粉启动有良好的作用。二是低温。研究证明，低温预处理可促石刁柏花药培养时产生更多愈伤组织[23]。三是激光照射。陈震古[24]对18种供试杨树的离体花药，用He-Ne 20 J/cm2激光照射，发现激光能促进花粉愈伤组织的芽分化。

2 林木多倍体育种

2.1 作用

植物染色体组加倍后，植物的形态和生理也会发生某些变化，使植株的生长速度提高，遗传品质得以改善，代谢物含量增加[25]。利用营养器官进行多倍体育种，可以克服多倍体育性差的问题，同时育成的品种可以长期持续利用。多倍体育种可用于短周期森林工业用材新品种的选育，比如与本地生长的山杨相比，欧洲山杨×美洲山杨杂种三倍体的材积、纤维长度、比重分别高1～2倍、18%、20%，是一种优良的纸浆原；多倍体育种可使利用组织代谢产物的经济树种品质性状得到改善，如四倍体橡胶树的产胶量比二倍体亲本提高34%[26]；多倍体植物的基因表达和酶的活性也相应增强，从而加强了植物对环境适应性，抗旱、抗寒以及抗病虫害等优势明显[27-28]。如四倍体泡桐的抗旱性与抗寒性均大于其二倍体[29]。

2.2 途径与方法

2.2.1 从自然界直接选择。多倍体在林木中是普遍存在的，甚至有个别个体表现突出，如欧洲山杨天然三倍体在生长及材质等方面均优于相同立地条件下的同龄二倍体[30]。在我国检出的5个毛白杨天然三倍体中，大多属于优良类型，如易县毛白杨雌株[31]。

2.2.2 体细胞染色体加倍。人类最早获取多倍体的途径就是体细胞加倍，在林木中获得的体细胞多倍体涉及杨树、橡胶、桉树、刺槐等[32-35]，但迄今只有四倍体刺槐等少数几个品种在生产上成功应用，大多主要用于作为研究材料。Gu等[36]以‘沾化冬枣’茎尖为外植体，在MS液体培养基添加秋水仙素并在暗处振荡，可以获得超过3%的加倍率。

2.2.3 不同倍性体间杂交。当某树种中存在有可育的不同倍性体时，利用不同倍性体杂交是获取新的多倍体最简捷有效的途径。Baumeister 等利用四倍体与二倍体杂交选育出三倍体欧美杨，其适应性及抗病能力强，树冠狭窄，材积生长较选育出的优良无性系快，被广泛应用于林业生产实践，并获得显著的经济效益[37]。

2.2.4 天然或人工未减数配子杂交。杨树可以直接利用天然未减数2n花粉进行多倍体育种，可通过人工诱导花粉染色体加倍进行多倍体育种。康向阳等综合花粉染色体加倍、花粉辐射和杂交育种等技术，高效获得白杨杂种三倍体育种技术体系[25]。橡胶树GT1可自然产生未减数2n雌配子，采用自然授粉种子育苗，其天然三倍体发生频率为0.72%[38]。

2.2.5 胚乳培养与细胞融合。目前，已在枸杞、枣、猕猴桃等经济林品种的胚乳培养方面取得三倍体苗木[39-41]。细胞融合可以克服植物远缘杂交障碍、创造多倍体。郭学民等研究表明，至2003年初，已获得木本植物近100个组合的体细胞杂种[42]。Xiao等[43]通过中华猕猴桃、狗枣猕猴桃体细胞融合研究获得再生植株，这种杂种植株的耐寒性明显高于中华猕猴桃。

3 问题及展望

花药培养是迄今为止创造纯合基因型的最有效手段，也是林木育种中不可缺少的育种技术，但是20世纪90年代以后长期处于半停滞状态。目前，花药培养在林木育种中又取得了一定的研究成果，但更多的还是应用在小麦、玉米等农作物育种中。其主要原因有，花药愈伤组织诱导分化难度大、获得的后代植株的倍性容易混乱，因此要通过花药培养获得林木单倍体植株的关键是能够有效抑制体细胞生长而不影响小孢子雄核发育。另外，林木花粉植株的诱导率总体上较低，难以形成足够的选择群体；林木花药培养对基因型的依赖性也较强，因此就会造成花药对离体培养反应和结果的不同。最后，与农作物相比，由于林木自身的特性使得林木花药培养机理研究仍旧处于初级阶段，因此今后多进行花药培养机理的研究，可以借助分子生物学手段来拓宽单倍体植株的获取途径。已有研究从基因角度探讨小孢子雄核发育的机制，甚至尝试通过诱导转座子获得双单倍体纯合突变体[44]。另外，随着科技的不断发展，产生单倍体的方法也在不断增多。研究表明，通过对花药培养反应较差的基因型再进行杂交育种，有助于促进其雄核发育[45]。因此，花药培养也将会在林木育种中取得进一步的发展。

在林木种群中虽然有天然多倍体的存在，但是所占的比重较小，所以鉴定十分困难。体细胞染色体加倍最终获得的大多是混倍体或嵌合体，影响了倍性优势的发挥，因此要加强对所获得的多倍体的鉴定。林木生命周期较长，多倍体植株综合性状的评价及其后代的繁殖也就需要较长的时间。因此，应尽量选择染色体数目较少的树种进行诱导。原生质体融合技术一直以来是获得优良杂交品种的常用方法，但通过该方法获得的杂种细胞或多倍体细胞进行育种结果都不理想，成果仅局限在几个物种上。因此，可以将所研究的物种范围扩大，对具有明显生态效益的树种加强研究，同时总结成功的经验，以作为其他树种的参考。三倍体植株的各方面性状往往被认为是最好的[46]，但获取很困难，成功案例就更少。其原因是三倍体不能从秋水仙碱溶液直接处理植物组织中产生。可以通过胚乳培养获得三倍体，但是胚乳培养过程中易产生染色体变异，造成再生植株多为非整倍体、混倍体，甚至恢复为二倍体等，因此胚乳培养技术有待进一步的改进。

总之，林木育种有一个飞跃性的发展，不能完全依赖于常规育种，利用基因组辅助育种[47]和分子设计育种，并和传统的育种方式相融合，可能会成为培育林木优良品种的发展趋势。

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