降解石油复合微生物菌剂的筛选研究

摘要： 从30个土样中筛选出3株高效原油降解菌株，它们为DCH-16，DCH-19和DCH-20，7天后降油率分别为75.6%，80.3%和73.2%。经鉴定，分别是脂肪酸芽孢杆菌属Alicycolobacillus，芽孢肠状杆菌属Sporomaculum和盐芽孢杆菌属Halobacillus。将此3株高效原油降解菌在原油培养基中进行复合实验，结果表明，在相同条件下复合菌降油效果优于单菌；菌株DCH-19与DCH-20复合的最佳原油降解条件为：接种量比1：1（总接种量为10%），pH值为7.5，底物浓度20mg・mL-1，温度35℃，原油降解时间为7天。将实验复筛所得部分降油菌用于胜华炼厂废水处理，效果最好的是菌DCH-19和DCH-20的复合，处理两天后降油率达到80.2%。表明复合菌株DCH-19和DCH-20有很强的适应能力。

Abstract： We select three strains of high efficient oil degrading strains from 30 soil samples， i.e. the DCH-16， DCH-19 and DCH-20. Seven days later， the oil degradation rate turns to 75.6%， 80.3% and 73.2%. The three strains are identified as the fatty acid bacillus Alicycolobacillus， Bacillus Sporomaculum and Bacillus Halobacillus. Thereafter， we use the three strains of high efficient degradation bacteria for the crude oil compound experiments. The result shows that the compound bacteria has much better efficiency than single bacteria， and the optimized condition for DCD-19 and DCH-20 is that： the inoculation ratio gets 1：1 with total inoculation 10%， the pH value is 7.5， the concentration of substrate is 20mg. mL-1， and the temperature reaches 35℃， then the degradation of crude oil will be 7 days. Further more， we introduce part of the microbial inoculants into the refinery wastewater treatment of Shenghua refinery. The compound DCH-19 and DCH-20 shows the best performance of petroleum degradation which is up to 80.2%.

关键词： 筛选；石油降解；复合生物菌；炼厂废水

Key words： selection；petroleum degradation；complex microbial inoculants；refinery wastewater

中图分类号：[P642.5] 文献标识码：A 文章编号：1006-4311（2013）13-0296-03

――――――――――――

作者简介：徐宝刚（1979-），男，山东潍坊人，工程师，工学学士，环境工程给排水专业硕士在读。

0 引言

据估计全世界每年约有1×109吨石油及其产品通过各种途径进入地下水、地表水及土壤中，随着经济的高速增长，我国石油的环境治理任务也日益紧迫。投加高效石油降解菌以强化石油类污染物的降解，以达到治理石油污染环境的目的势在必行。因此，通过筛选、组建以原油为底物的高效降解石油功能菌组合，寻求其生长最优条件，为降解石油复合菌用于石油污染治理提供一定的依据。

1 实验方法

1.1 降解石油菌株的筛选 从胜华炼厂以及石油大学钻井机旁采集被原油污染的土样，用原油培养基进行初筛、复筛、筛选出原油降解效果好的菌株。

1.2 降油率的计算 油浓度的计算：采用紫外分光光度计测定吸光度，通过绘制原油标准曲线，进行吸光度与油浓度的换算。

1.3 复合菌生长特点的描述 采用721分光光度计进行OD值的测定，以时间为横坐标，OD值为纵坐标作图。

1.4 复合菌株降解石油能力的初步研究

1.4.1 高效单菌的复合 将复筛得到的效果最好的3株菌，按不同组合方式接种于原油培养基，120r・min-1，30℃，摇床培养7天，7天后用紫外分光光度法测其含油量。

1.4.2 高效复合菌在原油培养基中的单因子实验 对上述得到的高效复合菌，通过只改变要确定的单因子，其他条件相同，来确定各因子（接种量比、底物浓度、温度、PH值、原油降解时间）的最佳值。

1.4.3 复合菌在原油培养基上的生长特点 在上述确定的最佳条件下，接种前述高效复合菌，每24h取一次样，用721分光光度计在600nm波长测其菌液浊度，即为OD600值。

1.5 复合菌在实际中的初步应用

1.5.1 菌株在炼厂废水中可生长性的研究 由于炼厂废水成分复杂，因此，通过观察菌株在增营和自然营养平板上的生长情况来确定菌株在废水中是否可生长，及营养物质的量是否适合菌的生长，以拟订后期实验方案。

1.5.2 复合菌对炼厂废水中原油的降解 通过前期实验已经知道复合菌对原油的降解比单菌效果好，因此，将上述炼厂废水高度适应菌接种于炼厂废水中（根据上述可生长性实验确定废水是否需要人工添加营养成分），120r・min-1，30℃，摇床培养2天，2天后用紫外分光光度法测其含油量。

2 实验结果和讨论

2.1 降解石油菌株的筛选 通过初筛和复筛后，得到效果最好的3株菌的原油去除率分别为：DCH-19：80.3%，DCH-16：75.6%，DCH-20：73.2%。生理生化鉴定结果表明：DCH-20为盐芽孢杆菌属（Halobacillus）；DCH-19为芽孢肠状杆菌属（Sporomaculum）；DCH-16脂肪酸芽孢杆菌属（Alicycolobaxillus）。

2.2 高效单菌复合的降油率 由表1可知，将三株高效单菌进行复合，相同条件下每一种复合都比单菌效果好，其中菌DCH-19与DCH-20复合降解率最高，为89.1%。

2.3 高效复合菌在原油培养基中的单因子实验

2.3.1 最佳接种量比的确定

由表2可知，D19：D20=1：1复合接种时降油率最高，为89.1%。其它接种量比都比单菌的降解率都低。原因是复合微生物只有按合适比例共同培养，才能充分发挥群体的联合作用优势，取得最佳应用效果。不合适的菌种比例对原油降解会产生抑制作用。

2.3.2 最佳底物浓度、温度、pH值的确定

由图1可以看出：①底物浓度较低时，原油降解率随底物浓度的增加而上升。根据微生物增长过程，原油浓度和微生物菌落的数量以及生物降解速率之间的关系：-dS/dt=KSX/Ks+S，当原油浓度S比较低时，可简写为：-dS/dt=KSX/Ks，由Monod方程？滋=？滋maxS/（Ks+S），在低培养基质浓度条件下，微生物增长速率随着基质浓度的增加而增加，因此，原油降解率随底物浓度增加而上升。②当底物浓度达到20mg・mL-1时，降解率达到最大值，为89.1%。③当底物浓度高于20mg・mL-1，原油降解率下降，这是因为石油浓度过高对许多石油降解菌的生长会产生抑制作用，甚至大量死亡，从而导致降油率下降。

由图2可以看出：

①当温度低于30℃时，原油降解率随温度升高线性增加。这是由于微生物酶的活性随温度升高而增强，从而降解速度加快。但温度低于30℃时，由于某些对微生物有毒害的低分子量石油烃类在低温下难挥发，油黏度增加，生物降解滞后，总体上看原油降解率相对比较低。

②当温度在30-35℃时，原油降解率基本保持恒定，35℃时达到最大值为90.9%。此时，微生物的代谢速度增加，烃类生物降解速度加快。

③35℃以后原油降解率迅速下降，这是由于温度不仅会影响石油烃类的物理性质和化学组成，还影响微生物的代谢速度和复合菌株之间的关系。过高的温度会抑制烃类的降解能力。

由图3可知：

①当pH

②当pH>7.5时，降油率随pH增大而下降。

③当pH在7.0-7.5时，降油率的变化不大，pH7.5时达到最大值为91.2%。因此，该复合菌的最佳原油降解pH应为7.0-7.5。这与复合菌长期生长在东营这块盐碱地上有关。

2.3.3 最佳原油降解时间的确定 经实验确定，复合菌7天后降油率为89.1%，8天、9天后虽然降解率比第7天少有提高，但提高不大，综合考虑，选择最佳原油降解时间为7天。

2.4 复合菌在原油培养基上的生长特点 图4表明，0-3天，菌株从发酵液转到原油培养基中，营养环境发生改变，复合菌生长迟缓；3-7天细菌细胞健壮，生长速度比较快，代谢能力较强；7-9天由于营养消耗、供应不足和有毒代谢产物的积累，菌体的生长速率与死亡速率达到动态平衡，总菌数不变或稍有增加。活菌数相对平衡并处于最大值。测得稳定阶段相对比较短，是由于原油毒性比较大，当菌群减少时，抵抗能力会下降所致；9天之后菌体中营养物质基本被耗竭，而且抑制细胞生长的毒物浓度愈来愈大，细胞死亡速率大于生长速率，细菌总数逐天减少。

2.5 复合菌在实际中的初步应用

2.5.1 菌株在炼厂废水中可生长性的研究结果

由表3可知：①上述实验中DCH-16是原油降解高效菌，但在炼厂废水中不生长，这与微生物的性质有关，不同微生物适合的环境和耐受毒物的能力不一样。②自然营养废水平板比增营废水平板的长得好一些，而且快一些，这是因为炼厂废水中的基础无机盐成分较多，足够满足一般菌的生长需要。添加无机盐，可能培养基中无机盐过剩，导致细菌中毒，适环境时间加长，菌株生长较慢。因此建议今后的复合对炼厂废水降解实验中不需添加基础无机盐，利用废水作为培养基，符合清洁生产。

2.5.2 复合菌对炼厂废水中原油降解的结果与讨论。由表4可知，在炼厂废水中，降油效果最好的是菌DCH-19和DCH-20的复合，2天降油率就达到80.2%。

3 实验结论

3.1 复合菌DCH-19和DCH-20有很强的适应能力，既能高效降解胜利混合原油培养基中原油，又能高效降解胜华炼厂废水中原油。

3.2 相同条件下复合菌降油效果优于单菌，在适宜的环境下，互相促进的菌按合适的比例复合会起到很好的降油效果。

参考文献：

[1]袁红莉，杨金水，等.降解石油微生物菌种的筛选及降解特性.中国环境科学，2003，23（2）：157.

[2]周长征，李秀云，等.三维荧光法在石油污染鉴别中的应用.光谱学与光谱分析，1998，18（4）：500-502.

[3]杨艳红，王伯初，等.复合微生物制剂的综合利用研究进展.重庆大学学报，2003，26（6）：81.