1,Rg1和Re调控Raf―CREB,Akt―CREB,CaMKⅡ―CREB信号转导通路的体外研究'> 人参皂苷Rb1,Rg1和Re调控Raf―CREB,Akt

[摘要] 目的：研究人参皂苷中的主要有效单体Rb1，Rg1和Re对神经营养因子细胞信号转导通路的影响。方法：建立以0.6 mmol・L-1的皮质酮作用于SH-SY5Y细胞24 h的损伤模型，加入Rb1（120，60，20 μmol・L-1），Rg1（120，80，40 μmol・L-1）和Re（120，80，40 μmol・L-1），CCK试剂盒检测Rb1，Rg1和Re对皮质酮诱导SH-SY5Y细胞损伤的存活率；利用脂质体转染的方法将含有CREB-Luc报告基因的质粒分别和含有hRaf，hAkt，hcAMP，hCaMK基因的质粒转染入人胚肾细胞（HEK293细胞），加入有效浓度人参皂苷Rb1，Rg1和Re后，用双荧光素酶报告基因系统和Western blotting方法检测CREB的表达情况。结果：CCK的测试结果表明人参皂苷Rb1（60 μmol・L-1），Rg1（80 μmol・L-1）和Re（80 μmol・L-1）对SH-SY5Y细胞具有明显的保护作用；报告基因检测方法显示加入Rb1和Rg1调控后Raf-CREB，Akt-CREB通路中CREB报告基因活性明显增强，加入Re调控后Raf-CREB，CaMKⅡ-CREB通路中CREB报告基因活性明显增强。Western blotting结果显示，Rb1和Rg1调控后Raf-CREB，Akt-CREB通路中CREB蛋白表达明显增强，Re调控后Raf-CREB，CaMKⅡ-CREB通路中CREB蛋白表达明显增强。结论：人参皂苷中的主要有效单体Rb1，Rg1和Re对皮质酮所致SY5Y细胞受损具有明显保护作用，其作用机制可能与调节神经营养因子细胞信号转导通路上游的Raf-CREB，Akt-CREB，CaMKⅡ-CREB通路有关。

[关键词] 人参皂苷Rb1，Rg1和Re 报告基因；神经营养因子信号转导通路

[收稿日期] 2014-01-20

[基金项目] 国家自然科学基金项目（81173430）

[通信作者] 刘屏，研究员，博士生导师，Tel：（010）66936676，E-mail：；陈宜鸿，主任药师，Tel：18601112676，E-mail：

[作者简介] 汪婷婷，硕士研究生，E-mail：

基于单胺递质和受体假说抑郁症发病机制理论的研究目前尚不能充分解释抗抑郁药的临床效应滞后现象，人们将研究焦点聚集到神经细胞信号转导分子水平上，信号转导途径具有级联放大作用，可以在下游引起成百上千个酶蛋白的活化，产生生物效应。cAMP反应元件结合蛋白CREB（cAMP-response element binding protein）是胞内与抑郁相关的几个信号转导通路中的一个交汇点[1-2]，在中枢神经系统中起着关键作用，可促进神经细胞的存活、再生、分化等。环磷酸腺苷（cAMP）通路，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，钙依赖蛋白激酶（CaMK）通路和葡萄糖合激酶3β（GSK-3β）通路形成了CREB的4条上游通路，这4条通路最终调节其下游通路的BDNF等基因表达，影响神经元的可塑性及神经递质的合成[3]。

人参是我国传统的名贵药材，文献报道其主要成分人参皂苷具有良好的抗抑郁作用和神经保护作用[4-6]，可减少其凋亡，促进核酸和蛋白质的形成；提高脑内乙酰胆碱的含量，使胆碱能神经M受体增加，对中枢神经系统呈双向调节作用[7-8]。目前关于人参皂苷抗抑郁的机制研究多集中在调节神经递质方面，而对其受体后细胞信号转导通路的影响，目前尚未见文献报道。本实验用外源性皮质酮造成细胞内高皮质酮环境，损伤神经细胞SY5Y来建立抑郁的体外模型，给予人参皂苷主要单体Rb1，Rg1和Re，用报告基因和Western blot 2种方法研究人参皂苷对CREB上游4条通路的调控作用，影响神经细胞的生长，分化和凋亡，从而发挥神经保护作用和抗抑郁作用。

1 材料

1.1 细胞株 SH-SY5Y细胞株购于上海细胞库；人胚肾细胞（HEK293细胞）由军事医学科学院2所高月教授惠赠。

1.2 药材与试剂 人参皂苷Rb1，Rg1和Re购自中国食品药品检定研究院（质量分数≥98.8%）；BDNF，皮质酮购自美国Sigma公司（纯度≥98.5%）；1640培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自Hyclone公司；Cell Counting Kit试剂盒购自北京泛博生化科技有限公司；基因质粒hAkt，hRaf-1，hCAMP，hCaM，ProCREB由北京信诺金达生物科技有限公司合成；表达载体pcDNA3.1+，荧光素酶报告基因载体pGL3-Luc，海肾荧光素酶报告基因载体pRL-TK，双荧光素酶报告基因检测系统，均购自Promega公司；Lipofectin2000购自Invitrogen公司；CREB抗体，β-actin和相应的二抗购自美国Abcam公司；RIPA裂解液购自北京Solarbio公司；Marker购自北京全式金试剂公司。

1.3 仪器 超净工作台（AIRTECH VS-1300L-U，日本）；二氧化碳培养箱（BINDER CB150，德国）；多标记微孔板分析仪（1420-02，美国PerkinElmer公司）；倒置显微镜（OLYMPUS IX51，日本）；电泳仪（BIO-RAD，美国）；UVP凝胶成像系统（EC3 Imaging Systems，美国）。

2 方法

2.1 细胞培养及分组 将SH-SY5Y细胞接种于75 mL的培养瓶，用含10%胎牛血清的1640培养基于37 ℃饱和湿度，5%CO2的培养箱中培养。隔天换液，取对数生长期的细胞进行后续试验，调整细胞密度为5×104个/孔接种于96孔培养板，培养24 h后，加入不同浓度的皮质酮（CORT）继续培养12，24 h，Cell Counting Kit试剂盒检测SH-SY5Y细胞的细胞活力。

取对数生长期的SH-SY5Y细胞接种于96孔板中，0.6 mmol・L-1的皮质酮损伤24 h后，各组细胞分别加入脑源性神经营养因子（BDNF，50 μg・L-1）；人参皂苷Rb1（120，60，20 μmol・L-1）；人参皂苷Rg1（120，80，40 μmol・L-1）和人参皂苷Re（120，80，40 μmol・L-1），继续培养24 h。Cell Counting Kit试剂盒检测SH-SY5Y细胞细胞活力，在酶标仪上测定450 nm处的吸光度A450nm，各实验组设置3个复孔。SH-SY5Y细胞存活率=（A实验组-A空白组）/（A对照组-A空白调零组）×100%。

2.2 荧光素酶报告基因表达载体的构建和鉴定 将空载体pcDNA3.1+和pGL3-Luc分别用HindⅢ和BamHⅠ双酶切。酶切产物用DNA胶回收试剂盒回收后，于16 ℃连接过夜，转化大肠杆菌TGⅠ用抗生素标记（Amp+）筛选，挑取菌落，用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，分别用HindⅢ和BamHⅠ双酶切及测序鉴定阳性克隆，再分别与质粒hAkt，hRaf-1，hcAMP，hCaMK，ProCREB用KpnⅠ和ApaⅠ双酶切。将双酶切后的PCR产物hAkt，hRaf-1，hcAMP，hCaMK分别插入载体空载体pcDNA3.1+中得到重组载体pcDNA3.1-Akt， pcDNA3.1-cAMP， pcDNA3.1-CaMK，pcDNA3.1-Raf-1，将ProCREB插入pcDNA3.1-Luc中得到重组载体pcDNA3.1-Luc-CREB。以上载体用紫外核酸分析仪测序并进一步鉴定。

2.3 脂质体介导的真核细胞瞬时转染 将处于对数生长期的HEK293细胞制备成单细胞悬液，按1×105个/孔接种至24孔板中，培养24 h后进行转染。将200 ng pcDNA3.1-Raf-1，200 ng pcDNA3.1-Luc-CREB，100 ng pRL-TK及2 μL Lipofectin2000分别稀释于50 μL无血清的PRMI1640中，在室温下放置5 min后，将Lipofectin2000与质粒充分混匀得到脂质体复合物，20 min后将脂质体复合物按每孔100 μL缓缓加入到24孔板中，轻轻摇匀，继续培养48 h。

2.4 加药刺激 人参皂苷Rb1用RPMI1640培养液溶解，配置成浓度60 μmol・L-1饱和溶液，人参皂苷Rg1和Re配置成80 μmol・L-1饱和溶液。转染后6 h换含有胎牛血清的RPMI1640培养液，3孔为1组，将Rb1，Rg1和Re加入到相应重组载体中，48 h后测定荧光素酶活性。

2.5 双荧光素酶检测分析 依照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明操作，用预冷PBS洗涤细胞2次，先加入20 μL细胞裂解液PLB待细胞充分裂解后加入100 μL荧光素酶测试试剂Ⅱ混合，在30 min内测定报告基因CREB荧光素酶活性，数值为M1，然后再加入100 μL Stop & GloTM试剂，30 min内测定内参质粒pRL-TK的荧光素酶活性，数值为M2，每组实验作3个复孔，每次数据重复3次转染实验确证。以M1/M2为被检测质粒转染细胞后所测得荧光素酶的相对活性。

2.6 Western blotting法检测CREB表达 转染后的HEK293细胞用PBS洗涤2次收集细胞，加入细胞裂解液冰置30 min后4 ℃，12 000 r・min-1离心30 min。取上清，BCA试剂盒蛋白定量，细胞总蛋白加入上样缓冲液煮沸变性。30 μg蛋白经10%SDS-PAGE胶分离后转移到PVDF膜，3%BSA室温封闭2 h，加入一抗CREB抗体4 ℃过夜，TBS-Tween洗膜后加HRP标记的二抗，室温孵育2 h，加入ECL发光液，进行检测。

2.7 统计学分析 所有实验数据以±s表示，采用SPSS 17.0软件进行统计学处理。2样本均数比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P

3 结果

3.1 人参皂苷Rb1，Rg1和Re对皮质酮所致神经细胞受损的保护作用 0.6 mmol・L-1CORT作用24 h后存活率下降为 67.21%，损伤作用明显，继续培养和加大剂量后细胞存活率明显下降。据此选择CORT浓度0.6 mmol・L-1作用24 h作为CORT损伤SH-SY5Y细胞模型。人参皂苷Rb1各剂量组（120，60，20 μmol・L-1），Rg1各剂量组（120，80，40 μmol・L-1），Re各剂量组（120，80，40 μmol・L-1）和BDNF因子对0.6 mmol・L-1CORT损伤24 h的SH-SY5Y细胞均有不同程度的保护作用，结果差异有显著性，其中Rb1 60 μmol・L-1，Rg1和Re 80 μmol・L-1保护作用最好，见表1，2。

3.2 重组质粒的成功构建 重组质粒pcDNA3.1-Raf/Akt/cAMP/CaMK/-Luc-CREB用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后内部存在HindⅢ和BamHⅠ酶切位点。在50 μL反应体系中经酶切鉴定结果出现了1个与理论值相符的条带2 000 bp，测序结果亦显示酶切鉴定正确的质粒准确插入DN段，其序列也正确，见图1。

3.3 CREB报告基因活性的检测 Rb1和Rg1能激活Raf-CREB和Akt-CREB通路上游的靶点增加CREB的报告基因活性，Re能激活Raf-CREB和CaMKⅡ-CREB通路上游的靶点增加CREB的报告基因活性，与未转染上游靶点基因的CREB组相比有显著差异（P

3.4 CREB蛋白的表达 Rb1和Rg1给药组中与未转染细胞通路上游靶点基因的CREB组相比，转染了Raf和Akt靶点的Raf-CREB组和Akt-CREB组中的CREB蛋白表达量明显增加，Re给药组中与未转染细胞通路上游靶点基因的CREB组相比，转染了Raf和CaMKⅡ靶点的Raf-CREB组和CaMKⅡ-CREB组中的CREB蛋白表达量明显增加（P

4 讨论

SH-SY5Y细胞目前被广泛应用于抑郁神经系统疾病发病机制和药物作用机制方面的研究，高浓度的皮质酮可对中枢神经系统造成损害，包括神经突触可塑性破坏和神经元生成受抑或者死亡[9]。本文采用皮质酮诱导损伤SH-SY5Y细胞株模拟抑郁状态的细胞模型，观察人参皂苷主要单体Rb1，Rg1和Re对SH-SY5Y细胞株的保护作用。结果表明，多个浓度CORT对SH-SY5Y细胞均有明显的损伤作用，且细胞的存活率呈浓度和时间依赖性下降，当皮质酮浓度为0.6 mmol・L-1，作用24 h后SH-SY5Y细胞存活率降低至67.21%，加入神经营养因子BDNF因子和人参皂苷单体Rb1，Rg1和Re后细胞存活率明显提高，并具有一定的剂量依赖性。其中人参皂苷Rb1和Rg1 60 μmol・L-1，Re 80 μmol・L-1时存活率最高分别为91.65%，89.65%，88.69%。

CREB是转录调节因子之一，通过CREB及其磷酸化介导信号转导通路调节，并最终调控其下游脑源性神经营养因子BDNF的基因表达，影响神经元的可塑性及神经递质的合成。CREB可被多种不同的信号转导路径激活，cAMP通路（cAMP-PKA-CREB），MAPK通路（Raf-MAPK-CREB），CaMK通路（Ca-CaMK-CREB）和GSK-3β通路（AKT-GSK-3β-CREB）这4条通路是目前研究认为激活CREB的主要信号转导路径[10]，而CREB作为上述通路的交汇点，已成为抗抑郁治疗的新的分子靶点[11]。本研究建立抗抑郁细胞信号转导通路模型，以CREB为目的基因，将4条通路的上游靶点基因和CREB目的基因构成复合质粒并在CREB上连接报告基因Luc（Raf-CREB-Luc，cAMP-CREB-Luc，CaMKⅡ-CREB-Luc，AKT-CREB-Luc），通过瞬时转染转染到细胞中[12-13]，并以不转染上游靶点基因的CREB-Luc作为空白模型对照，给予人参皂苷各主要单体Rb1，Rg1和Re，通过检测报告基因的活性来反映目的基因CREB的活性，同时用Western blot的方法检测转染上游靶基因后目的基因CREB的蛋白表达情况。综合CREB基因和蛋白水平上的变化来判断人参皂苷Rb1，Rg1和Re如何通过信号转导通路影响神经细胞的生长。

结果表明人参皂苷个主要单体Rb1，Rg1和Re均能通过MAPK通路发挥作用。MAPK在脑中大量存在，最近几年被证实在调节长时程中枢系统功能方面参与整合多种突触间信息传递，更重要的是MAPK通路可调节啮齿类动物对环境和压力的反应[14]。影响GSK-3β通路的主要是人参皂苷Rb1和Rg1，AKT通路在调节神经存活方面有着重要作用，AKT磷酸化可以抑制促凋亡家族成员Bcl，从而抑制神经细胞凋亡[15]。影响CaMK通路的则主要是人参皂苷Re，CaMK是细胞内Ca2+信号转导途径中的主要信号转导分子，介导调控Ca2+引起的一系列生理生化反应，参与并调节细胞的增生、分化、运动等，促进细胞的增殖[12]。总之，人参皂苷各主要单体Rb1，Rg1和Re能保护皮质酮所致SH-SY5Y神经细胞损伤，本文认为可能的机制是Rb1和Rg1通过激活MAPK通路和GSK-3β通路来调节神经元细胞的长时程和细胞的突触可塑性来保护细胞，而Re可能是通过激活MAPK通路和CaMK通路来抑制神经细胞凋亡和促进细胞增殖来实现保护作用的。

本文用多种方法研究出了人参主要单体如何通过不同的信号转导通路来发挥对神经细胞保护作用，意在阐明中药的多途径和多靶点作用，为利用其神经生物学特性研发起效快，安全机制强的抗抑郁新药提供参考。

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In vitro studies of Raf-CREB， Akt-CREB， and CaMKⅡ-CREB signal

transduction pathway regulated by ginsenosides Rb1， Rg1and Re

WANG Ting-ting， DONG Xian-zhe， LIU Wan-wan， CHEN Yi-hong， LIU Ping

（1.Department of Clinical Pharmacology， Center of Pharmacy， Chinese PLA General Hospital， Beijing 100853， China；

2. Department of Medical and Social Security， Chinese PLA General Hospital， Beijing 100853， China；

3.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 300193， China）

[Abstract] Objective： Effects of ginsenoside Rb1，Rg1 and Re on neurotrophic factor signal transduction pathway using liposome-mediated transfection of eukaryotic cells approach. Method： The injury model was established by treating SH-SY5Y cells with 0.6 mmol・L-1 of corticosterone（CORT） by 24 h. SH-SY5Y cell were pretreated with CORT for 30 min followed by co-treated with 120，60 and 20 μmol・L-1 of Rb1， 120， 80 and 40 μmol・L-1 of Rg1 and 120， 80 and 40 μmol・L-1 of Re for 24 h. Cells viability was determined by Cell Counting Kit（CCK） assay. CREB expressing Luciferase reporter gene was constructed and transfected with plasmid containing hRaf， hcAMP， hAkt， hCaMK gene into human embryonic kidney（HEK293） cells using liposornal transfection reagent lipofection 2000. The expression of CREB before and after it addion of Rb1，Rg1 and Re was examined by Luc assay system and Western blotting. Result： Compared with normal control group， CORT significantly decreased the viability of SH-SY5Y cells to 67.21%（P

[Key words] ginsenoside Rb1，Rg1 and Re reporter gene； neurotrophic factor signal transduction pathway

doi：10.4268/cjcmm20141124