用大鼠原代心肌细胞构建工程化心肌组织的研究

作者：常海霞，郑强荪,刘兴光

【摘要】 目的 探索用大鼠原代心肌细胞构建工程化心肌组织的方法。方法 用胶原、Matrigel、2倍DMEM分别与含0.04%EDTA的0.25%胰酶制备的乳鼠原代心肌细胞（实验组）和0.1%胰酶制备的原代心肌细胞（对照组）混合，注入环形槽内形成心肌条带，一周后行力学拉伸继续培养一周。常规HE染色等对组织工程化心肌组织，即心肌条带进行评价。结果 心肌条带出现自发性跳动，HE染色显示与正常成年大鼠心肌组织类似，电镜结果显示条带中的心肌细胞含有丰富的肌原纤维,肌小节结构和Z带清晰可见。用含0.04%EDTA的0.25%胰酶制备的原代乳鼠心肌细胞构建的心肌条带，拉伸后第4天形成一致性跳动。免疫组化检测提示肌钙蛋白阳性细胞数多于对照组。电镜观察显示，条带的心肌细胞中肌原纤维较对照组明显增多。结论 这一方法可构建工程化心肌组织，心肌细胞制备方法的改进以及液态Ⅰ型胶原浓度的精确测定，可显著提高构建心肌条带的成功率及条带的生理功能，使其更接近正常心肌组织。

【关键词】 原代心肌细胞;液态Ⅰ型胶原;工程化心肌组织

基金项目： 全军医学科研“十五”计划项目自主（No.01MB126）

Experimental Study of Engineered Heart Tissue Using Neonatal Rat Primary Cardiomyocytes

Abstract: OBJECTIVE To construct engineered heart tissue (EHT) using neonatal rat primary cardiomyocytes.METHODS Liquid collagen type I, Matrigel and 2×DMEM were mixed with neonatal rat cardiac myocytes isolated using 0.25% trypsin including 0.04% EDTA,or 0.1% trypsin only as a control. The mixture was then pippetted into circular molds to construct cardiac ring. 7 days later, the cardiac ring was subjected to 10 % static stretch for another 7 days. microscopy and transmission electron microscopy, routine HE staining and immunohistochemical staining were used to analyze the EHTs.RESULTS Spontaneous beating was seen in the EHTs. HE staining revealed that cardiac myocytes within the EHTs resembled that of the nativecardiac tissue in morphology. Transmission electron microscopy revealed that the cardiac myocytes within the EHTs contained abundant myofibrils, clearly defined sarcomeres and Z lines. The EHTs constructed using the cardiac myocytes isolated by 0.25% trypsin supplemented with 0.04% EDTA finally came to synchronous beating at the fourth day of stretching. Histological and immunohistochemical analysis also showed more positive cardiac myocytes and more myofibrils per cell than in the control group.CONCLUSION The method described in this study is helpful in constructing tissue engineered heart tissue. The improved technique for cardiac myocyte isolation and accurate quantification of liquid collagen type I are beneficial to EHTs construction and the EHTs are likely to share more structural and functional similarities with that of similar to the native heart tissue.

Key words：Primary cardiac myocyte; Liquid collagen type I; Engineered heart tissue(EHT)

本实验旨在对在体外构建和重现心脏组织的方法进行探索，寻找能够构建类似正常心肌组织的方法，这一方法2002年德国的科学家Zimmermann等人的研究中首次使用［1-3］，军事医学科学院赵云山等对其进行了改进［4］，在此基础上我们对构建的方法做了进一步改进，并对影响因素进行了总结，对所涉及的传统方法做了改良和细化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

DMEM(美国Sigma公司),胎牛血清(北京元亨圣马生物技术研究所),胰酶(美国Sigma公司),基质蛋白(Matrigel,美国Sigma公司),生物核素标记的羊抗小鼠试剂盒(中山试剂公司),DAB显色试剂盒(中山试剂公司)，肌钙蛋白T（福州迈新公司，1∶100）。

1.1.2 动物

新生SD乳鼠,由第四军医大学动物中心提供。

1.1.3 仪器及装置

相差显微镜，CO2培养箱,铸模装置(自制),动态拉伸装置(自制)。

1.2 方法

1.2.1 Ⅰ型胶原浓度的测定

胶原溶液的制备见文献［5］。取1 ml加在经称量过的质量相同的十张纸上，编号记录数据，另取相同质量的十张纸（编号记录数据）同时放入120℃的恒温箱中烘干24 h，取出立即称取各纸的质量并记录，计算烘烤前后未加胶原的纸的质量差，每一纸的差值除以该纸未烘烤前的质量，为该纸单位质量烘烤后失重，求平均值，所得为单位质量纸在烘烤中所失量。用该平均值乘以加胶原纸在烘烤前的质量，为该纸本身在烘烤后所失质量。求出加胶原的纸烘烤前后的重量差值，再减去纸本身所失质量即为1 ml胶原溶液中胶原的质量，求平均值，即为胶原的浓度（mg/ml）。浓度在3.0～4.5 mg/ml均可，本试验制备的胶原为4.0 mg/ml。

1.2.2 心肌细胞的分离

新生1～2d的SD乳鼠于75%酒精中浸泡处死，无菌条件下取心脏,PBS清洗，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小。实验组加入适量含0.04%EDTA的0.25%胰酶，吹打静置后取上清，入血清中终止消化，剩余组织重复操作至完全消化。1000 rpm离心5 min，弃上清，加入培养液，于5%CO2、37℃培养箱中,培养1h(差速贴壁),收集液体，离心弃上清后所得细胞主要是心肌细胞。大多数文献中认为0.1%的胰酶制备心肌细胞比较理想［5］，故本实验中选用该浓度为对照组。收集的心室组织块中加入0.1%的胰酶置于37℃水浴中消化8 min取上清,入血清终止消化。剩余组织重复以上操作,直到组织消化完全。之后同实验组。各组取等量细胞行二维培养。

1.2.3 组织工程化心肌条带的制备

液态Ⅰ型胶原与2×DMEM等比例混合,用0.1 mol/L NaOH调定至中性,再加入10%的Matrigel。将终浓度为4×107/ml分离的心肌细胞与上述混合物混合,加入环形槽中，总量1ml，胶原1.0 mg，其它成分的量按比例换算。置5%CO2、37℃培养箱中。混合物凝固后，加含20%血清的DMEM培养液。1 d后，可见心肌条带有明显的回缩，去除琼脂，加入上述培养液，5%CO2、37℃培养箱中培养7天。制备实验组40个心肌条带，对照组40个心肌条带,其中各组有10条不加Matrigel。

1.2.4 力学刺激方式

心肌条带培养7d后,套在动态拉伸装置上,调整间距,使在静止时条带处于自然状态的最大间距，拉伸频率为60次/分,继续培养7d。

1.2.5 组织工程化心肌条带检测方法

心肌条带培养14 d后,行各种检查，具体方法如下:(1)大体观察:肉眼及光镜观察条带在培养期间跳动情况。(2)免疫组织化学染色:样品经包埋,石蜡切片,脱蜡,复水，抗原修复，0.1%TritonX-100、0.3%H2O2的甲醇溶液孵育10 min，冲洗，封闭血清作用15 min，弃血清,加一抗:肌钙蛋白T,4℃过夜。PBS漂洗20 min,加二抗,37℃孵育15 min;PBS漂洗20 min,辣根标记的链霉卵白素作用15 min。PBS漂洗20 min,DAB显色,水洗10 min，透明,封片。(3)透射电镜观察:3%的戊二醛固定标本,包埋切片,透射电镜观察。

1.3 统计学处理

计数资料以百分率表示，采用X2检验：P<0.05为有显著性差异。

2 结 果

2.1 肉眼及光镜观察

实验组制备的心肌细胞在二维培养中，活力非常好，立体感强，成纤维细胞增殖不明显。对照组的心肌细胞由于成纤维细胞的大量增殖，第3天细胞变得很难观察。实验组构建的心肌条带培养第4天出现局部的节律性搏动，在拉伸后第4天形成肉眼可见的一致跳动。对照组的心肌条带培养第6天后出现散在的跳动点，拉伸后第6天出现肉眼可见一致跳动。没有加Matrigel的20个心肌条带在培养的第3天之后出现过度回缩。

2.2 免疫组织化学染色观察

条带中细胞分布均匀,沿拉伸方向伸展,胞核长梭形，实验组的肌钙蛋白阳性细胞数（占总细胞数的75%左右）较对照组的肌钙蛋白阳性细胞数（占总细胞数的60%左右）明显多（P<0.05），细胞排列较整齐，沿拉伸方向的细胞比例多于对照组(图1A,1B,1C)。

2.3电镜观察

电镜观察显示,条带中心肌细胞含有排列整齐的肌原纤维,并沿着细胞的长轴方向伸展,肌小节结构和Z带清晰可见,但是在实验组(图2A)中肌原纤维的数量较对照组(图2B)明显多，而且整齐，有横管结构，形成的肌小节较对照组接近正常心肌细胞。

3 讨 论

有三个主要因素影响构建心肌条带的成功率：1）细胞活力，这是最至关重要的；2）支架材料的选择和添加量;3）细胞外因子的作用。

传统方法消化心肌需要在37℃水浴中长时间震荡［5-8］，我们提高胰酶浓度至0.25％的基础上加0.04％EDTA，可大大缩减消化时间，不需水浴震荡。在二维培养中用0.25％胰酶加0.04％EDTA制备的心肌细胞明显优于0.1％胰酶制备的心肌细胞，制备的心肌细胞活力佳，立体感强，对成纤维细胞有明显的竞争性抑制作用，限制其过度生长，可以推测这种心肌细胞主动纯化过程使其本身有了更多的营养供给和生存空间，从而发育的更完全更成熟。电镜的结果显示用实验组构建的心肌条带中，心肌细胞的肌原纤维的数量较对照组明显多，形成的肌小节也明显较对照组接近正常心肌细胞。这些结果说明0.25％胰酶加0.04％EDTA这样的消化酶浓度更适合于心肌细胞的制备，它可以大大缩短消化酶对心肌细胞的破坏时间，也就在一定程度上保护了心肌细胞，使其正常生理状态下的活力得以保持，从而具备了与成纤维细胞竞争营养物质的能力。

本试验选择的支架材料为液态Ⅰ型胶原，一种天然生物的大分子材料，正常心肌组织中细胞外基质的主要成份。胶原用成年大鼠鼠尾制备，本实验中所用的心肌细胞也来源于大鼠，两者具有很好的组织相容性。液态Ⅰ型胶原用碱性溶液中后会凝固，凝固的Ⅰ型胶原有很好的弹性，能承受心肌细胞所产生的牵拉。在构建心肌条带时，胶原的添加量是其他成分添加量的参数，如果无法确定或模糊处理会使构建心肌条带的成功率很难把握。现有制备胶原的方法虽然很简单，却没有成熟的测量胶原浓度的方法，本实验经过反复摸索总结出一套行之有效的简单测量方法，减少了成本，而且也提高了测定胶原的精确性。

本试验中借鉴Zimmermann等在体外构建心肌组织的方法，在其中添加Matrigel，它的主要成分是层粘连蛋白、型蛋白、黏结蛋白等，在加Matrigel后条带出现跳动的时间要相应地延长［2］。在培养中发现加有Matrigel的条带不会发生过度回缩现象，而不加Matrigel的条带在培养中由于过度回缩导致条带内部大量细胞坏死，收缩能力越来越弱，逐渐崩解。这说明加Matrigel有利于条带内部细胞的营养供给，从而延长了条带的寿命。

体外构建工程化心肌组织，细胞的活力是影响结果的关键因素，本实验采用的方法不仅提高了心肌细胞的活力，在一定程度上限制了成纤维细胞的生长，而支架材料添加量的精确，使得心肌细胞的收缩能力得到了最大化的体现，从而使构建的组织更加接近正常生理状态的心肌组织。

【参考文献】

［1］Catherine Z. The beat goes on［J］. Nature, 2003, 421(5):884-886.

［2］Eschenhagen T, Didie M, Munzel F,et al.3D engineered heart tissue for replacement therapy［J］.Basic Res Cardio,2002,97(4):146-152.

［3］Zimmermann WH, Melnychenko I, Eschenhagenb T.Engineered heart tissue for regeneration of diseased hearts［J］ .Biomaterials,2004,25 (9) :1639-1647.

［4］赵云山,王常勇,郭希民,等.以液态胶原为支架构建组织工程化心肌组织的实验研究［J］.中华医学杂志,2004,84(9):766-770.

［5］薛庆喜.体外培养的原理与技术［M］.北京科学出版社,2001,202.

［6］杨晓宁,田宗文,黄焕斌,等.新生大鼠心肌细胞的体外培养［J］.武汉大学研究生学报,2004,20(2):11-13.

［7］杨芬,李莹辉,聂捷琳,等.模拟微重力条件下新生大鼠心肌细胞三维培养体系的构建［J］.中国修复重建外科杂志,2002,18(2):119-112.

［8］董丰,龚开政,张振刚,等.原代心肌细胞培养方法的探讨［J］.大连医科大报,2001,23(4):307-308.