产紫杉醇内生真菌O60B1的分离及鉴定

摘要：从曼地亚红豆杉（Taxus x media）树皮内表皮中分离得到1株产紫杉醇的内生真菌O60B1，并通过高效液相色谱法（HPLC）和质谱法（MS）分析其发酵产物，其紫杉醇产量为2.5～3.0 μg/g（紫杉醇/菌丝干重），并通过形态学特征和18 S rDNA序列分析，将其初步鉴定为毛霉属（Mucor sp.）真菌。

关键词：红豆杉（Taxus x media）；紫杉醇；内生真菌；18 S rDNA；毛霉（Mucor sp.）

中图分类号：S459 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2012）23-5315-03

Isolation and Identification of A Taxol-producing Endophytic Fungus O60B1

ZHANG Peng1，2，LIU Bo2，XU Man2，AO Ming-zhang2，FU Chun-hua2，YU Long-jiang2，GU Yu-cheng1

（1. Institute of Industrial Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China； 2. Institute of Resource Biology and Biotechnology， College of Life Science and Technology， Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430074，China）

Abstract： A taxol-producing endophytic fungus O60B1 was isolated from the inner bark of Taxus x media. It could produce 2.5～3.0 μg taxol per one gram dry weight of mycelium according to determination of high performance liquid chromatography（HPLC） and mass spectrometry（MS）. The fungus O60B1 was defined as Mucor sp. through morphological observation and 18 S rDNA sequence analysis.

Key words： Taxus x media； taxol； endophytic fungi； 18 S rDNA； Mucor

紫杉醇是最先分离自红豆杉的高效抗肿瘤药物[1，2]。但由于红豆杉资源稀缺，直接从红豆杉植物中提取紫杉醇无法满足市场需求，利用微生物发酵法生产紫杉醇是解决紫杉醇药源紧缺问题的有效途径之一[3-6]。目前已有30多种产紫杉醇真菌被报道，但大多数真菌的紫杉醇产量都较低，无法进行工业化生产[3-5]。除了通过基因工程或诱变等手段提高已发现的内生真菌的紫杉醇产量外，人们仍在积极地从自然界中筛选紫杉醇高产菌株。

本研究从曼地亚红豆杉树皮内表皮中筛选得到1株产紫杉醇内生真菌O60B1，并通过形态学观察和18 S rDNA序列分析将其鉴定为毛霉属（Mucor sp.）真菌，为微生物发酵法生产紫杉醇提供了具有潜在应用价值的新菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

曼地亚红豆杉树皮样品采自华中科技大学校园苗圃。真菌分离及培养用培养基为PDA培养基（Potato dextrose agar）和PDL（Potato dextrose liquid）培养基，发酵培养基为YES培养基[7]。紫杉醇标样购自Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 内生真菌的分离与纯化 内生真菌的分离和纯化参照已报道的方法[7，8]，经纯化后的内生真菌接种于PDA斜面保存于4 ℃冰箱。

1.2.2 紫杉醇的提取及HPLC-MS分析 内生真菌紫杉醇的提取及高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）和质谱法（Mass spectrum，MS）分析参照已建立的方法[7-9]。HPLC分析的色谱仪为Agilent 1200 HPLC System。质谱分析由华中科技大学分析测试中心完成，仪器为Agilent 1100 LC/MSD trap。

1.2.3 真菌形态观察 将内生真菌菌株于PDA斜面活化2～3代后，接种于PDA培养基平板，25～28 ℃培养2周，观察其菌落的形态特征和生长情况，包括菌落形状、生长速度、表面特征以及产生孢子体的能力等；并采用水浸制片法观察，即在载玻片上滴加1滴去离子水，用解剖针从平板上挑取少量带有孢子的菌丝，放入水滴中并轻轻用解剖针将菌丝分散，盖上盖玻片后，在显微镜下观察菌丝特征，包括菌丝体的粗细、有隔和分枝情况、颜色等，以及分生孢子体的特征，如大小、性状、色泽等。

1.2.4 18 S rDNA序列分析 将内生真菌接种在20 mL PDL培养基中，28 ℃、100 r/min培养3～5 d后收集菌丝，并采用上海雷浩信息科技有限公司的 Sp fungal DNA kit提取其基因组DNA，18 S rDNA序列的扩增引物为18S-F1（5′-GATCCTGCCAGTAGT

CATATGC-3′）和18S-ITS2（5′-GCTGCGTTCATCGA

TGC-3′），扩增条件参照文献[7]。引物合成和核酸测序由上海桑尼生物科技有限公司完成，测序结果通过Blast在线比对分析（http：//blast. ncbi. nlm.nih.gov/Blast）。

2 结果与分析

将12块曼地亚红豆杉树皮的内表皮接植于PDA平板，培养过程中不断分离新长出的内生真菌，最终经分离、纯化获得菌落形态及生长周期不同的内生真菌20株，分别将其接种到300 mL的真菌液体发酵培养基中，25℃、180 r/min培养10 d后，收集菌丝并提取其紫杉醇进行HPLC分析，结果（图1）表明，紫杉醇标准品的保留时间约为10.3 min，菌株O60B1的提取物在此保留时间也有明显的特征峰，且与标样的保留时间基本一致（10.2 min），初步确定该真菌可产紫杉醇，紫杉醇产量约为2.5～3.0 μg/g（紫杉醇/菌丝干重）。进一步对内生真菌O60B1的紫杉醇提取物进行质谱分析，结果（图2）表明，以Na+轰击后，内生真菌O60B1紫杉醇提取物具有和紫杉醇标准品一样的特征峰（（M+Na）+=876）[10]，质谱分析结果进一步说明了内生真菌O60B1可以生产紫杉醇。

内生真菌O60B1在25～28 ℃温度下在PDA平板上生长迅速，培养2 d后菌落直径约为4.6 cm （图3A），初生菌丝为白色，在成长过程中菌丝逐渐变成浅灰色。菌丝粗大，无明显的隔、多核，分枝较少（图3B）。孢囊梗单生，直立，顶端着生椭球形孢子囊（图3C）。可观察到两种形态的孢子（图3D-F）：孢囊孢子为白色椭圆形孢子，表面光滑（图3D）；另外一种孢子为黄褐色椭形孢子，较大，推测为接合孢子或者厚垣孢子（图3E-F）。根据内生真菌O60B1的形态观察，对照《真菌鉴定手册》[11]，发现其与毛霉属菌极为相似。

此外，也对内生真菌O60B1进行了初步的分子鉴定，提取其基因组DNA（图4A）后进行18 S rDNA扩增，结果表明：获得1条约2.0 kb大小的扩增片段（图4B）；序列分析结果表明，产紫杉醇内生真菌O60B1的18 S rDNA序列与毛霉菌（Mucor sp. EIM-10）的18 S rDNA序列（GenBank No. EU793999.1）有95%一致性；与毛霉菌（Mucor plumbeus strain UPSC 1492）的18 S rDNA序列（GenBank No. AF548078.1）有95%一致性。因此，根据其形态特征和18 S rDNA序列分析结果，初步将O60B1鉴定为毛霉菌属（Mucor sp.）真菌。

3 讨论

由于紫杉醇药源植物红豆杉天然资源有限且紫杉醇含量极低，限制了紫杉醇在临床和科研上的广泛应用。1993年人们首次从太平洋短叶红豆杉（Taxus brevifolia）分离到产紫杉醇的内生真菌-安德鲁紫杉菌（Taxomyces andreanae）[12]，为人们展示了一条利用微生物发酵生产紫杉醇的新的药源途径。由于微生物具有生长迅速、易培养、发酵周期短、生产成本低、易于通过诱变或者基因工程手段迅速提高其紫杉醇产量等优点，因此，利用微生物发酵法生产紫杉醇成为解决紫杉醇药源紧缺的有效途径之一。但目前发现的大多数产紫杉醇内生真菌的紫杉醇产量都很低，仍不适合工业化应用。本研究从曼地亚红豆杉中分离获得1株紫杉醇产量为2.5～3.0 μg/g的内生真菌O60B1，并将其初步鉴定为毛霉菌属真菌。该菌株虽然紫杉醇产量较低，但其生长迅速，是1株具有潜在应用价值的产紫杉醇真菌。本实验室希望通过优化发酵条件，以及通过诱变育种或基因工程技术对其进行遗传改造，提高其紫杉醇产量，为微生物发酵生产紫杉醇提供新的菌种。

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