猪脾脏多肽的酶法制各及其生物活性研究

摘要：目的探索酶解法制备猪脾脏多肽的最佳条件，检测所得产物的生物活性。方法用胰酶酶解法、正交试验、甲醛滴定法考察最佳酶解条件，用乙醇沉淀法收集多肽，并分别用Fe2+诱发卵黄脂蛋白多不饱和脂肪酸过氧化体系和纤维蛋白平板法检测多肽的抗氧化活性和溶栓活性，CM－Sepharose离子交换层析纯化最佳酶解条件下的脾多肽，利用SDS－PAGE电泳确定具备促凝活性的多肽分子片段相对分子质量。结果最佳酶解条件为60℃，pH7.0，加酶量6.0％，时间5.5h；检测到脾多肽具备抗氧化活性和促凝活性，经纯化后的脾多肽促凝时间比正常对照提前20s。结论可初步判断猪脾脏多肽在抗氧化和凝血方面有一定作用，且首次证实猪脾多肽具有凝血功能。

关键词：猪脾脏；多肽；抗氧化；促凝

中图分类号：Q556

文献标识码：A

文章编号：1672－979X(2010)05－0161-04

近几十年来，多肽在人体中的作用引起了学术界的高度重视。多肽是涉及各种细胞功能的生物活性物质，几乎所有细胞都能合成多肽，并受多肽调节。鉴于一些多肽在人体生长发育、细胞分化、大脑活动、肿瘤病变、免疫防御、生殖控制、抗衰老及分子进化等方面具有特殊功能，研发多肽类药物成为近年生命科学研究的热点，从理论上讲，脾水解物、肝水解物和组织提取液均应含有多种活性多肽物质，但需要系统、深入地研究予以证实。目前猪脾肽的研究主要集中在免疫活性方面，如转移因子、抑癌因子等的研究与应用。国内外对脾转移因子都有深入的研究，德国有以猪脾肽为活性成分的制剂(商品名保尔佳)。近年研究发现羊脾提取液有抗氧化活性，但猪脾的抗氧化功能未见报道。我国生猪养殖业发达，但大量猪脾被丢弃浪费。本文探索了猪脾脏多肽的制备工艺及其抗氧化功能。考虑到脾是重要的造血器官，还首次研究了其凝血活性。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

猪脾匀浆(德阳生化制品公司)。

试剂：2％胰酶、胰蛋白酶(1:250，德阳生化制品公司)；乙醚、甲醛(37％～40％)、浓硫酸、双氧水(30％)、三氯乙酸、Na2HPO4・12H2O、KH2PO4、硫酸铵、总胆汁酸(TBA)、FeSO4，7H2O、乙醇、丙酮、Tris等均为分析纯；凝血酶(400NIH单位，中科院输血研究所)；冻干人纤维蛋白原(上海莱士血制品公司)。

仪器：LD5－2A型离心机(北京医用离心机厂)；HS－4恒温水浴锅(太仓科教器材厂)；751－GW紫外－可见分光光度仪(上海安捷伦公司)：DYY－Ⅲ28A型垂直板电泳槽(北京六一仪器厂)；PHS－3C精密pH计(上海雷磁仪器厂)。

1.2脾脏多肽酶法制备的工艺探索

1.2.1　工艺流程脾匀浆－乙醚脱脂，酶解，终止反应－离心－酶解液－多肽粗品－CM－Sepharose离子交换层析(促凝活性多肽纯化)。

1.2.2酶的选择选择胰酶和胰蛋白酶，加酶量5％、酶解条件60℃、pH7.0，恒温水浴搅拌酶解5％，并用1.0mol／L氢氧化钠溶液维持pH值。之后沸水浴10min终止水解反应。用甲醛滴定法测定水解度。

1.2.3确定胰酶水解的最佳条件60℃、pH7.0条件下分别水解4.5，5.0，5.5，6.0h，测定水解度，确定最佳酶解时间。从温度、pH值和加酶量3方面进行3因素3水平正交试验考察，确定较佳的工艺条件。

1.3脾脏多肽的收集与纯化

乙醇沉淀：80％乙醇室温处理，静置15min，离心收集沉淀，冻干，即获得脾脏多肽粗品。用CM－Sepharose Fast Flow离子交换层析纯化。用0.067moFL磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡，将粗品上样后静置30min，再用磷酸盐缓冲液(pH6.0)洗涤，用含02mol／L氯化钠的磷酸盐缓冲液(pH6.0)洗脱。收集各峰并检测活性。

1.4分析方法

1.4.1脾脏多肽粗品的抗氧化活性检测用包斌等Fe2+诱发卵黄脂蛋白多不饱和脂肪酸(PUFA)过氧化体系检测脾脏多肽粗品的抗氧化活性。

1.4.2纤溶活性检测用琼脂糖一纤维蛋白平板法。为了增加灵敏度，同时用改良的纤维蛋白平板法检测猪脾脏多肽粗品以及CM－Sepharose Fast Flow纯化产物的纤溶活性。

1.4.3促凝活性检测配制含50mmol／L Tris-HCl、0.15mol／L氯化钠溶液，调pH至7.4，加入重组人纤维蛋白原，配成4mg／mL重组人纤维蛋白原溶液。每次取1mL加入直径8mm试管中，加入多肽溶液(乙醇提取所得粗品多肽以及CM－Sepharose Fast Flow纯化产物用蒸馏水溶解配成0.1g／mL溶液)4uL，再加入400NIH单位的凝血酶液2uL，静置，观察是否凝固。空白对照以蒸馏水代替多肽。

1.4.4多肽含量测定　以牛血清白蛋白标准品做标准曲线，用Bradford法检测多肽含量。

1.4.5 SDS-PAGE电泳　将最佳水解条件下酶解液，乙醇收集、离子交换层析所得的多肽，参照SDS－PAGE电泳操作方法进行电泳，检测纯化效果。

2　结果

2.1脾脏多肽的酶法制备及酶解条件探索

2.1.1酶的选择根据文献，分别用胰酶、胰蛋白酶水解猪脾脏脱脂匀浆，测定水解度。结果表明，胰蛋白酶水解度为70.7％，胰酶水解度为69.3％，使用胰蛋白酶水解度高于使用胰酶，但差异不显著。

2.1.2最佳酶解时间在最适理论条件下，使用胰酶分别水解猪脾脏脱脂匀浆4.5，5.0，5.5，6.0 h，测定水解度，其结果分别为56.1％，57.5％，57.9％，56.1％，水解5.5h时，水解度最大。

2.1.3最佳酶解条件探索按正交试验设计要求，不同条件下用胰酶水解猪脾脏脱脂匀浆，水解时间5.5h，测定水解度，结果见表1。

由表1可见，加酶量和pH值对水解度影响较大，温度影响相对较小，经极差分析可见，最佳酶解条件为A2B2C3，即60℃、pH7.0、加酶量6.0％。

2.1.4猪脾多肽的收集与纯化本实验采用80％乙醇沉淀法收集多肽是由于此浓度的乙醇可产生大量沉淀，通过离心即可有效分离，并可节省去盐步骤。

2.2脾脏多肽粗品的抗氧化活性检测及条件探索

经实验，样品在Fe2+诱发卵黄脂蛋白过不饱和脂肪酸过氧化体系中表现出了一定的抗氧化活性。

由表2可见，猪脾多肽具备抗氧化活性，最佳抗氧化活性的酶解条件是65℃、pH8.0、加酶量5.0％。其中影响因素pH>加酶量>温度，但只限于粗品，有待进一步纯化。将最佳抗氧化酶解条件下收集的多肽粗品与对应的酶解液、维生素C的抗氧化活性进行对比，见表3。

由表3可见，酶解后的多肽抗氧化活性增加，且比酶解液、维生素c的值大，有一定的研究价值。

2.3纤溶活性与促凝活性

2.3.1纤溶活性在2种平板上均未观察到纤溶圈，表明猪脾脏多肽不具备溶栓活性。

2.3.2促凝活性未检测到明显的抗凝活性。但发现加入多肽后加速了凝血，表明脾多肽具备促凝活性，即具备凝血功能。本测定是在凝血过程中凝血酶形成后，以纤维蛋白形成的过程为考察点，纤维蛋白凝固时间越短，止血功能越大，但其机制包括凝血启动、多成份酶复合物形成、凝血酶原活化、凝血酶形成、纤维蛋白形成等，而脾多肽的凝血机制并不明确，本实验无法进行定量测定，有待下一步探索。

2.4促凝活性脾多肽的纯化及SDS-PAGE电泳

由离子交换层析(图1)和电泳(图2)可见，经过离子交换层析得到了单一多肽(峰c)，纯度较高，由电泳图可见其相对分子质量约为1.1×104。此外，实验测得多肽粗品经纯化后可获得脾多肽含量为4.12mg／g，分别对酶解液、纯化多肽进行15组平行实验测定其止血活性，结果见表4。

由表4可见纯化后的多肽促凝时间比正常状态提前了20s。经统计学处理，纯化多肽的促凝时间与正常对照、酶解液样品的差异有极显著的统计学意义(P

3　讨论

本实验水解度测定采用刘玉兰等甲醛滴定法的消化方式，该法消化迅速，消化时间由原2h缩短至10min，而测定结果与凯氏定氮标准法基本一致，偏差

本文通过胰酶水解法制备多肽，并通过研究水解脾多肽的相关活性发现，猪脾脏多肽具备抗氧化活性和促凝活性，经过离子交换层析得到较单一的多肽片段，其相对分子质量约为1.1×104，显示实验所得猪脾水解多肽在抗氧化和促凝血方面具有一定的作用，但需进一步研究，以确定具备最佳活性的有关单一成分的结构、性质与功能。