钙激活钾通道α亚单位与高血压关系的研究

[摘要] 了解调节血管张力的靶点及内源性活性物质配体的BKca通道的特性，有助于深入研究通道特性及临床治疗药物筛选。用脂质体（lipofectamine2000）转染法转染BKca表达质粒pcDNA3.1-BKca筛选稳定表达单克隆细胞系研究其基本的生理学特性，同时建立BKca动力学研究模型。建立稳定转染BKca通道α亚单位的HEK293细胞系，通过膜片钳记录到与天然细胞BKca电生理BKca相似电流，可以用于分析通道动力模型及药物动力学作用机制。成功建立稳定转染BKca通道α亚单位的HEK293细胞系，膜片钳实验证明具有典型的BKca电生理特性，同时建立细胞系可以较好的运用于BKca通道功能调控研究和动力学参数分析。

[关键词] 大电导钙激活钾通道；α亚单位；高血压

[中图分类号] R544.1 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）02-47-03

大电导钙激活钾通道（Bkca）广泛分布于哺乳动物平滑肌、骨骼肌以及神经元上，其中平滑肌上分布最为丰富。Bkca在维持和调节平滑肌张力机制中发挥重要作用，具有典型的电压敏感性，与高血压的发生发展以及临床降压药物的治疗效果具有密不可分的联系。平滑肌上BKca通道包括形成孔道的α和调节性β1两个膜亚基。BKca通道是目前研究降压药物的重点和难点。研究表明α亚单位是BKca的基本功能单位，负责BKca通道离子的流动，决定BKca的K+选择性和Ca2+敏感性，从而影响血管的健康状况。目前已经将利用膜片钳技术探讨BKcaα亚单位活性及表达，作为研究降压治疗药物的直接依据。笔者于2012年6月～2013年6月期间通过脂质体（lipofectamine2000）转染法转染BKca表达质粒pcDNA3.1-BKca筛选稳定表达单克隆细胞系研究其基本的生理学特性，同时建立BKca动力学研究模型了解调节血管张力的靶点及内源性活性物质配体的BKca通道的特性。本文拟就Bkca的分子结构、生理功能，及利用膜片钳技术对BKcaα亚单位的活性及表达进行探讨研究，对钙激活钾通道α亚单位与高血压及降压药物疗效的关系进行综述。

1 BKca通道

1.1 BKca通道总论

BKca通道是具有大电导并由Ca2+激活K+通道，是相当高的单通道电导（large-conductance，Ca2+-activated K+ channel，BKca通道），早在1981年牛嗜铬细胞（chromafin cells）[1]中被发现，BK通道在不同组织，细胞和荷尔蒙环境下有不同的显性特征，例如在调节血管张力，血流量及血压调控作用等很多生物学过程起着非常重要的作用。大电导Ca2+ 激活的K+通道（BKca）也称为slo或Maxik通道[2]，除了受电压调节外还受胞内微摩尔浓度范围内的Ca2+调节，去极化时电导非常大，一般在200ps左右。BKca通道由每个α亚单位结合一个β亚单位之后再形成的BKca通道的四聚体[3]组成。α亚单位质量约为125kDa，分别由1200个氨基酸残基组成。β1β2β3β4四个亚基构成β亚单位，分别由191，235，257-279，210个氨基酸残基组成，质量约为22，27.1，29.1-31.6，29kDa.在各种兴奋性和非兴奋细胞中都存在有BKca通道，在BKca通道中如果α亚基的不表达，会导致失禁，膀胱过度兴奋，而它的删除会影响小脑功能并产生耳聋现象，BKca通道β亚基在平滑肌细胞中，通过调节兴奋-收缩耦联参与正常血压维持的生理过程，其参与多种疾病的病理过程，所以目前BKca通道已成为很多重要的药物作用的靶点。

1.1.1 BKca通道α亚单位分子结构及特性 BKca通道α亚单位分3种（slo1，slo2，slo3），是功能性的结构单位，由一个钾通道功能的依赖电压激活的核心区域（S0～S8）及一个高度保守的同钙调节相关的近羧基端的尾区域（S9～S10），而S0是α亚单位近氨基末端的跨膜片段，其区别于其他电压依赖型通道，对β亚单位起重要的调节作用[4]。

1.1.2 BKca通道β亚单位的分子结构及特性 由两个跨膜（transmembrane，TM）单位组成β亚单位，它的多样性是由位于胞质（Cytoplasm）中COOH-末端和NH2-末端决定的，其由一个大的胞外环状结构（-loop-）相连，它的重要性在于它与α亚基的结合能明显的改变BK通道的各种电性质，另外α亚基和β亚基结合的多种类组合是造成原代细胞中的BK通道电性质不确定性的根源，这也是构成BKca通道功能多样性结构学基础。

1.2 BKca通道α亚单位的由来

1991年在果蝇（Drosophila）slowpoke基因座上了发现BKca通道的α亚单位。其广泛表达于线虫类（Caenorhabditis，nematods），昆虫类（Drosophia，insects）以及哺乳类（mammmls）等多种物质中。由于消除了肌肉和神经元中Ca2+激活K+通道的电流，所以这些通道又被简称为dslo[3]。

1.3 α亚单位组织的分布

BK通道通过蛋白质免疫学和原位杂交检测表明，α、β亚单位在动物多种组织细胞广泛存在。例如苍白球、纹状体等神经组织细胞[5-6]，平滑肌细胞等肌细胞[7]，心肌细胞、以及肾细胞，胰β细胞等腺细胞[8-9]。

1.4 BKca通道α亚基的识别

目前识别BKca通道分子的手段主要为免疫印迹[5-10]，免疫组织化及原位杂交等，针对α抗原决定族的抗体均位于C末端LS8-S9之后的区域，其中抗体和抗原最为关键。

1.5 α亚基功能结构域及调控

α亚单位是离子孔道部分，有7个跨膜片段（S0-S6），连通细胞外的N端于α亚单位链接，而4个胞内疏水片段（S7-S10）和数个剪接点通过细胞膜内的C端连接α亚单位通过N端连接β。根据功能α亚单位分为：（1）电压敏感区，由S1-S4片段组成，主要感受细胞膜电位变化。（2）孔道区，用S5-S6片段组成，主要调控通道在不同刺激下的通透性。（3）细胞内区域，由S7-S10组成，感知多种配体的细胞内区域，而S0是人区别于其他钙激活钾离子通道的结构域，它可以结合β亚单位的调节起重要作用。

1.5.1 K+的选择性通道 BKca通道的孔道部分位于4个α亚单位的中心，而每个α亚单位上分别由S5，S6和P-loop共同组成。离子选择特异性由六个保守的氨基酸残基（TVGYGD）组成的结构域决定，而在第5，6跨膜区之间的孔道区间[11]，S6结构域被认为该K+选择性孔道的关键。根据MacKinnon的假说，BKca通道模拟了K+水合物中氧原子排列的情形，通过选择区氧原子排列让足够多的K+进入孔道，然后选择过的K+又重新被水包裹住。水化后的K+不仅降低静电排斥力，也使离子重复进行传导，也为高效率转运K+提供了基础。

1.5.2 BKca通道α亚单位对Ca2+敏感性 BKca通道α亚单位C末端有一个由RCK结构域和Ca2+球两个可能结构单元决定的通道活性区域，该区域现在研究认为，参与对胞质Ca2+的依存性[12]。在果蝇和哺乳动物的克隆之间表现了最高的序列的保守性，它由N末端的7个跨膜片段（S0-S6）、S5与S6片段之间的1个孔区和胞内C末端的4个疏水片段（S7-S10）组成。疏水跨膜片段S0可与之结合，其中β亚基调节α亚基的功能；C末端区域包括S7与S8片段，含有K+电导调节区域（RCK），每一个RCK区域包含一个Ca2+结合点；S9和S10片段之间有着钙敏感性的结合点，其称为“钙池”（calcium bowl）的负电荷区域。

2 α亚单位与高血压的关系

随着物质生活的不断改善，高血压一直以来困扰着人类，它严重威胁人们的健康。目前认为高血压是一种以动脉血压持续升高为特征“心血管综合征”。现在血管平滑肌细胞（vaucular smooth muscle cells ，VSMCs）中至少已确认存在4种钾通道，其通道影响动脉的张力及直径，不仅调节VSMCs的膜电势（membrane equilibrium potential，Em），也是许多血管活性物质的作用靶点。经大鼠实验证明BKca主要调节VSMCs舒缩和负反馈调节小动脉肌源性紧张等方面，而电压依赖性Ca2+通道导致细胞内Ca2+浓度升高，从而引起BKca通道活性增强。胡志等[13]学者报道表明，BKca通道活性增强会伴随着VSMCs通道α亚单位表达增强，通过荧光染色发现BKcaα亚单位主要分布在高血压大鼠VSMCs胞膜上，肠系膜动脉电流密度增加，可能与α亚单位表达及合成增强有关，也可能与电流密度增加引起血管的舒张[14]，不能抵消平滑肌细胞肌源性收缩有关。观察BKca与血管平滑肌细胞周期和增殖内在联系，可见阻断或开放BKca能调节血管平滑肌细胞增殖，具体的机制可能与改变细胞内Ca2+浓度有关。高血压发病时细胞膜离子转运发生异常，包括Na+、K+协同转运缺陷、细胞膜通透性增强、钠泵活性降低，最终导致膜电位降低，Ca2+浓度升高，使血管平滑肌肥大增生、反应收缩性增强，增高血管阻力，血压升高。由此可推断，降低Ca2+依赖性进行血管平滑肌细胞，即可降低血管阻力，降低血压。自发性高血压大鼠研究中发现，血压升高可引起电压依赖Ca2+通道上调，检测出BKca代偿性过表达，因此血管平滑肌细胞膜上电压依赖性Ca2+通道对于促发血管平滑肌收缩和血管肌源性紧张度密切相关。

综上所述，BKca通道是较为广泛分布在血管平滑肌的细胞膜上，其电压敏感性，胞内钙敏感性，大电导特征性决定在调节血管平滑肌张力机制中起重要作用。对BKca通道的研究成为目前在临床降压用药的热点和重点，很多研究表明α亚单位是BKca的基本功能单位，其负责BKca通道离子的流动，决定BKca的K+选择性和Ca2+敏感性，从而影响血管的健康状况，目前将利用膜片钳技术对BKcaα亚单位的活性及表达进行探讨研究，为进一步临床选择降压药物提供直接的依据。

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（收稿日期：2013-11-07）