维拉帕米对缺氧复氧心肌细胞自噬的影响

摘要：目的观察维拉帕米对缺氧/复氧心肌细胞的自噬相关基因Beclin1及抗凋亡基因Bcl2 基因的影响，探讨钙离子拮抗剂维拉帕米对心肌细胞的保护作用机制。方法建立心肌细胞的缺氧/复氧（ H/R）模型，用噻唑蓝染色法（MTT法）检测心肌细胞的存活率，实时荧光定量法（RTPCR法）测自噬相关基因Beclin1、LC3 mRNA的表达量及凋亡相关基因Bcl2 mRNA的表达量。结果与正常对照组相比，缺氧/复氧组心肌细胞存活率降低，同时Beclin1及LC3 mRNA的表达量增加，Bcl2 mRNA的表达量降低（P

关键词：心肌细胞；缺氧/复氧；自噬；凋亡；维拉帕米

中图分类号：R3291.2R256.2文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.16721349.2014.03.050文章编号：16721349（2014）03034302

心肌细胞在缺氧/复氧过程中有不同程度的自噬参与。在缺氧/复氧的不同阶段，自噬所起的作用不同。在缺氧期，自噬主要起保护作用，而复氧期则主要起损伤作用[1，2]。如何通过抑制自噬降低缺氧/复氧心肌细胞的死亡，提高其存活率，是目前研究的热点[3]。本文采用体外培养心肌细胞，建立缺氧/复氧模型，模拟在体缺血/再灌注损伤过程，从基因水平上观察心肌细胞在缺氧/复氧过程中给予维拉帕米后对心肌细胞的保护作用。为缺血/再灌注心肌细胞的进一步治疗提供帮助。

1材料与方法

1.1实验动物购自博研（上海）生物科技有限公司。

1.2主要药品与试剂盐酸维拉帕米注射液购自上海禾丰制药有限公司；胎牛血清购自四季青，浙江天杭生物科技有限公司；DMEM购自赛默飞世尔生物化学制品有限公司； Trizonal购自北京康为世纪生物科技有限公司； PCR反转录试剂盒购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司；PCR引物由生物工程（上海）股份有限公司设计； 3MA购自selleckchem公司；连二亚硫酸钠购自sigma公司；DMSO购自sigma公司；MTT（四氮唑蓝）Amresco公司；SYBR染料购自北京全式金生物技术有限公司。主要仪器，LSB50L型立式压力蒸气灭菌器：江阴滨江医疗设备厂L550型台式低速大容量离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司；倒置显微镜：上海电子仪器厂二氧化碳培养箱：Heraeus公司；德国 AB104N型电子天平：上海电子仪器厂；SWCJ2F超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司QPCR仪：美国BIORAD公司。

1.3乳鼠心肌细胞的培养H9c2心肌细胞复苏后置于37℃，5%二氧化碳培养箱中培养，倒置相差显微镜下观察心肌细胞的形态，隔天用DHanks液为心肌细胞换液，生长至约80%时，传代培养，采用第3代～4代心肌细胞进行实验。

1.4建立缺氧/复氧模型及实验分组缺氧/复氧模型的建立[4]：采用连二亚硫酸钠化学法，用DHanks液将其配成浓度为18 g/L，分装，置-20℃冰箱中保存，临用时稀释成终浓度为5 mmol/L，加入DMEM培养液中，制成缺氧液。用缺氧液换用正常培养基培养1 h，模拟缺氧过程，再换用正常DMEM培养液（复氧液）培养4 h，模拟复氧过程。将培养第3代～4代传代心肌细胞随机分为5组，空白对照组：正常DMEM培养基+胎牛血清培养；缺氧/复氧组[4]：将DMEM培养液换成缺氧液培养1 h，再换用复氧液培养4 h，即为缺氧/复氧处理。缺氧/复氧+3MA组：在缺氧液中加入终浓度为5 mmol/L[5]的3MA培养1 h[6]，再换用终浓度为5 mmol/L的3MA复氧液培养4 h。缺氧/复氧+维拉帕米组：在缺氧液中加入终浓度为1 mg/L的维拉帕米培养1 h，再换用终浓度为1 mg/L的维拉帕米复氧液培养4 h。缺氧/复氧+3MA+维拉帕米组：在缺氧液中加入终浓度为1 mg/L的维拉帕米与终浓度为5 mmol/L的3MA共同培养1 h，再换用含终浓度为1 mg/L的维拉帕米与终浓度为5 mmol/L的3MA复氧液共同培养4 h。

1.5MTT法检测心肌细胞的存活率[7]采用对数生长期的心肌细胞（第3～4代心肌细胞），按上述分组方法进行分组，然后0.25%胰酶消化后用DMEM培养液调成浓度为约5×104/mL的单细胞悬液，分配至96板孔中，每孔约100 μL，每组设10个复孔，置于37℃，5%二氧化碳培养箱中培养24 h后，吸弃上清液，加入MTT工作液（5 g/L），每孔约10 μL；37℃，5%二氧化碳培养箱中继续培养4 h，吸弃培养基，加入每孔200 μLDMSO终止反应，置于摇床上轻微震荡10 min。在酶标仪570 nm波长下测定吸光度A值。细胞存活率（survival rate SR）：SR/%=（A实验组/A对照组）1）100%。

1.6RTPCR法检测Beclin1、LC3 mRNA及Bcl2 mRNA的表达采用Trizonal试剂法按照Trizonal试剂说明提取总RNA。MJ PCR仪进行PCR反转录，反转录液： 总RNA2 μL，RNAase Free dH2O 6 μL，总量10 μL，共配5份；反转录程序：37℃ 15 min 85℃ 5 s 4℃ 1 h，cDNA置于1 mL EP管中。RTPCR反应液体系：Template 2 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，21）mix 10 μL，ddH2O 7.2 μL，总体积20 μL，共配体系20份。总体系配好后，用枪吸打均匀，54 μL每份中加入6 μL模板，分装至8连管中，每组设3个复孔。实验采用βactin作为内参，置于qPCR仪中，程序：94℃ 30 s，94℃ 5 s，60℃ 30 s，95℃ 1 h，55℃ 1 h，55℃ 20 s，共扩增45个循环。

1.7统计学处理采用SPSS 16.0统计软件处理，定量资料采用均数±标准差（x±s）描述，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSDt检验。检验水准α=0.05。

2结果

2.1对心肌细胞存活率的影响与正常对照组相比，缺氧/复氧组心肌细胞存活率降低（P

表15组心肌细胞存活率的比较（x±s）组别1n1细胞存活率（%）空白对照组110197.78±1.43H/R组110157.37±5.861）维拉帕米组110179.29±3.361）2）3MA组110194.65±2.652）3）3MA+维拉帕米组110196.76±2.772）3） F值11238.564 P110.001与空白对照比较，1）P

2.2Beclin1、LC3 及Bcl2 mRNA的表达RTPCR结果显示：与空白对照组相比，缺氧/复氧组Beclin1、LC3 mRNA表达量均上调（P

3讨论

近年来，与传统死亡方式凋亡相比，人们更加关注Ⅱ型程序性死亡方式自噬[8]。自噬的发生是首先形成自噬体，然后自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，最后降解其所包裹的内容物。其中，自噬发生的重要环节在于自噬体的形成[9]。自噬体的形成需要多种自噬相关基因（Atg）的参与[9]，如：Beclin1（酵母Atg6的同源），Atg5，Atg16，Atg，12，Atg8（LC3的同源）等。雷帕霉素通路（mTOR通路）及Bcl2/Beclin1通路是两条熟知的自噬信号调节通路。在自噬体调节过程中，Atg12Atg5Atg16可与LC3及Atg9一起被转运至自噬泡，参与自噬泡的扩展。同时，磷脂酰激酶3（PI3K）可与Beclin1结合，形成复合体负责调控自噬体膜的凝集，并包裹蛋白质，蛋白质复合体及细胞器。Bcl2/Beclin1通路中，Bcl2可通过结合并抑制PI3K复合体的重要组成成分Beclin1来抑制这一过程。而3MA作为一种非特异性的PI3K抑制剂，参与抑制自噬体形成的过程[10]。

在细胞自噬的诱导和调节过程中，许多刺激因子均可以诱导细胞产生自噬，如营养缺乏、缺血、缺氧、细胞内钙超载、氧化应激及内质网应激等。缺氧/复氧损伤可以导致心肌细胞钙超载，而钙离子拮抗剂维拉帕米可通过拮抗钙超载从而保护心肌细胞[11]。

自噬在缺氧/复氧过程中的调节起“双刃剑”作用。在缺氧过程中，通过Beclin1、Atg5，LC3等的上调激活自噬，起保护作用，而在再灌注过程中，自噬测过度表达则影响细胞的存活率。

本实验成功建立体外缺氧/复氧模型，模拟在体缺血再灌注损伤过程。通过预实验发现不同浓度维拉帕米对缺氧/复氧心肌细胞存活率影响不同，表明浓度为1 mg/L的维拉帕米较其他浓度对缺氧/复氧心肌细胞存活率高。提示适宜浓度维拉帕米预处理可发挥对缺氧/复氧损伤心肌细胞的保护作用。而自噬抑制剂3MA在复氧时使用，使Beclin1、LC3 mRNA表达量下降，同时，提高了细胞的存活率，而维拉帕米使Bcl2 mRNA表达量增加，Beclin1、LC3 mRNA表达量下降，自噬抑制剂3MA合用维拉帕米可使Bcl2 mRNA表达量增加，与单用维拉帕米差异无统计学意义，Beclin1、LC3 mRNA表达量下降，差异有统计学意义。表明维拉帕米可能通过Bcl2/Beclin1通路抑制LC3的表达，提高缺氧/复氧心肌细胞的存活率，从而保护心肌细胞。维拉帕米处理对缺氧/复氧心肌细胞有保护作用，推测Bcl2 /Beclin1通路在其保护机制中发挥重要作用。其具体机制有待进一步研究。

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作者简介：侯贞秀，女，硕士研究生，现就读于山西医科大学研究生（邮编：030001）；李哲，工作于山西医科大学第一临床医院。

（收稿日期：20130626）