益母草中益母草碱的HPLC检测

【摘要】 目的 建立益母草中益母草碱的HPLC检测方法。方法 C18色谱柱,流动相:甲醇pH=1.7的醋酸/醋酸钠缓冲液(体积比85∶15),流速0.6 mL·min-1,检测波长277 nm,灵敏度0.1AUFS,柱温25 ℃。结果 益母草药材中益母草碱的质量分数为0.015%;平均回收率为100.08%,RSD为0.15%。结论 高效液相色谱直接检测益母草碱,简便易行,结果准确可靠。

【关键词】 益母草;益母草碱;高效液相色谱法

益母草为唇形科植物益母草(Leonurus heterophyllus Sweet)的干燥地上部分,以花蕾期的地上部分的干品或鲜品入药,性味苦、辛、微寒,归肝、心包经,具有活血调经、化瘀生新、收缩子宫之功效,主治月经不调、胎漏难产、行经腹痛及产后淤阻等证,素有“血家圣药”、“经产良药”之称。益母草中主要含有生物碱类、二萜类、甾醇、黄酮类、有机酸、脂肪酸类等成分。益母草中生物碱以益母草碱和水苏碱为主[1]。药理作用研究证明,益母草中的主要有效成分益母草碱(leonurine)具有显着的直接扩张外周血管、增加血流量、抗血小板聚集活性等作用[2],可有效的降低血液黏度和提高红细胞的变形能力,还可调经止血,保护心肌缺血再灌注损伤。在《中国药典》[3]及各级别标准中,益母草药材和益母草制剂的质量控制均是以总生物碱为指标,文献[4,5]则采用雷氏盐剩余比色法测定益母草中盐酸水苏碱。而对于益母草碱的含量却没有要求,这样不能保证益母草及其制剂的安全、有效。以益母草为原料的多种制剂,如益母草胶囊、益母草冲剂、益母草口服液、益母草浸膏、益母草片等都是临床上的常用品,除个别品种在《中国药典》2005年版增加了含量测定项目外,多数品种无统一标准,有的品种则无含量测定要求,使市售的产品质量得不到保证。所以建立一个以益母草碱为指标直接检测益母草药材及其制剂的统一的质量标准是很有意义的。本文尝试建立益母草碱的高效液相色谱直接检测方法。

1 仪器与材料

高效液相色谱仪LabAlliance, LabAlliance紫外检测器Model 5000, Phenomenex C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),Anastar色谱工作站;紫外分光光度计,SHIMADZU公司,UV2401PC。甲醇为一级色谱纯;益母草碱对照品(购于安徽省新星药物开发有限责任公司,纯度为99%);益母草(购于天津市南开区协和药店,经我校中药学院中药鉴定教研室张丽娟副教授鉴定)。

2 方法与结果

2.1 紫外光谱最大吸收测定 在200~400 nm之间进行全波长扫描,扫描图如图1所示,益母草碱在215 nm和277 nm处均有吸收峰,最大吸收277 nm,故选用277 nm作为高效液相测定的波长。

2.2 色谱条件色谱柱:Phenomenex C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相:甲醇pH=1.7的醋酸/醋酸钠缓冲溶液(体积比85∶15),流速:0.6 mL·min-1,检测波长:277 nm,灵敏度:0.1AUFS,柱温:25 ℃,进样量:20 μL。

2.3 对照品溶液的制备精密称取盐酸益母草碱0.6 mg,溶于25 mL流动相中,摇匀,制得0.024 mg·mL-1对照品溶液。分别取对照品溶液0.5、 1.0、1.5、2.0、5 mL溶于5 mL流动相中,分别摇匀,得质量浓度分别为00024、0.0048、0.0072、0.0096、0.024 mg·mL-1的对照品溶液。各用微孔滤膜滤过后,按“2.2.1”项下的色谱条件进样测定(HPLC分析如图2所示),测得各溶液峰面积,计算得回归方程:C=2.222×10-8A-6.213×10-4,r=0.9998。益母草碱在00024~0.024 mg·mL-1间呈现良好的线性关系。

图1 全波长扫描图(略)

Fig.1 Wavelength scanning of motherwort alkaloids

图2 对照品HPLC分析图(略)

Fig.2 HPLC chromatogram of reference substance

2.4 样品溶液的制备精密称取益母草提取物粗品2.2 mg,溶于10 mL流动相中,摇匀即得。

2.5 样品溶液的测定取样品溶液用微孔滤膜滤过后,按“2.2.1”项下的色谱条件进样测定,测得溶液的峰面积为1 099 398,计算质量分数为10.82%,在原药材中的质量分数为0.015%。

2.6 精密度试验取同一样品溶液,按“2.2.1”项色谱条件下重复进样6次,测得峰面积分别为1 106 469、1 110 843、1 099 260、1 106 190、1 103 044、1 112 296,平均峰面积为1 106 350.3,计算得RSD=0.98%。表明仪器精密度符合要求。

2.7 稳定性试验取同一样品溶液于室温下在配制后的0、2、4、6、8、10、12 h,按“2.2.1”项下的色谱条件进样测定,测得峰面积分别为1 108 469、1 099 351、1 120 020、1 123 215、1 110 362、1 109 472、1 137 277,平均峰面积为1 115 452.3,结果RSD=1.11%,可见供试品溶液在室温条件下12 h内稳定。

2.8 重现性试验取同一样品溶液6份,按“2.2.1”项下色谱条件分别测定测得质量分数分别为10.82%、1083%、10.79%、10.80%、10.81%、10.83%,平均为10.81%,RSD=0.15%。

2.9 加样回收率试验取益母草碱粗制品3.6 mg,用流动相溶解后,精密加入益母草碱对照品0.4 mg,溶液适量,置于25 mL容量瓶中,以流动相定容至刻度,摇匀。再按样品测定方法操作测定,测得6次的峰面积分别为790 165、786 492、807 343、810 706、799 324、813 338,平均峰面积为801 228,结果计算回收率为100.08%,RSD=1.54%。

3 讨论

3.1 波长的确定 在200~400 nm之间进行全波长扫描,发现有两个吸收峰,215 nm和277 nm,但是215 nm有可能受到甲醇吸收的影响,而且在277 nm处没有其他成分的干扰,所以选择最大吸收波长277 nm作为检测波长。

3.2 色谱条件的建立 分别考察了不同体积比的甲醇水、甲醇水三乙胺、甲醇水冰醋酸、甲醇缓冲溶液等流动相,最终选择甲醇缓冲溶液作为流动相。选择用酸性流动相,是因为益母草中益母草碱的存在形式有可能有两种,即益母草碱单体及其盐类,利用酸性流动相可以转化成盐类一种形式,测定时只出现单一的峰。选择缓冲溶液,是因为缓冲溶液是一个平衡体系,比较稳定,有利于实验的进行。

3.3 本文是在完成了分离益母草碱和水苏碱的基础上实现了益母草碱的高效液相色谱的直接检测方法,为益母草药材的质量控制及其他益母草制剂的质量控制提供了依据。该方法简便易行,结果准确可靠。

【参考文献】

[1] 郑虎占,董泽宏,佘靖.中药现代研究与应用[M].北京:学苑出版社,1998:3803.

[2] 丁伯平,熊莺,徐朝阳,等.益母草碱对急性血瘀证大鼠血液流变学的影响[J].中国中医药科技,2004,11(1):36.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[S].北京:化学工业出版社,2005:203.

[4] 安伟建.中药益母草有效成分提取和测定方法的研究进展[J].天津药学[

！],2003,15(3):68.

[5] 晁志,周秀佳.益母草类中药研究概况与进展[J].中草药,1998,29(6):414-417.