神术散方不同提取物体内抗甲型流感病毒作用的研究

（1.南京中医药大学药学院，江苏南京210046；2.江苏省方剂研究重点实验室，江苏南京210046；

3.南京中医药大学附属医院，江苏南京210029）

摘要：目的：观察神术散方中不同提取物抗甲型流感病毒的作用。方法：以甲型流感病毒(A/PR8/34)滴鼻感染小鼠，以利巴韦林作为阳性对照药，观察神术散方中不同提取物对小鼠病毒致小鼠死亡率等影响。结果：神术散方不同提取物对甲型流感病毒(A/PR8/34)感染小鼠具有不同程度的延长存活的时间作用，其中，羌活去油水提液的保护率为56.3%，加减甘草醇提物神术散方超临界提取物的保护率分别为50%和43.75%，与病毒模型组比较具有显著性差异（P

关键词：神术散；提取物；抗甲型流感病毒

中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-2197（2008）10-0030-03

“神术散”方源于宋《杨氏家藏方》卷三［1］。并收载于宋代官修方书《太平惠民和剂局方》卷之二，它是由苍术、藁本、白芷、羌活、细辛、川芎、甘草等七味中药组成的复方，主治四时瘟疫，头痛项强，发热憎寒，身体疼痛及伤风鼻塞，声重，咳嗽头昏［2］，为历代医家治疗瘟病犯卫的经典方。为传承经典医方，研制防治流行性感冒现代中药成方制剂，本实验以甲型流感病毒滴鼻感染小鼠，观察神术散及其组成药味的不同提取物对甲型流感病毒感染小鼠的保护作用。

1仪器与试剂

1.1仪器

超净工作台（苏州净化设备厂），孵箱（上海分析仪器厂），FA1004电子分析天平（上海天平厂）。

1.2药材

苍术为菊科植物北苍术Atractylodeschinensis(DC)Koidz.的干燥根茎，购自内蒙通辽；白芷为伞形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch.exHoffm)Benth.etHook.f干燥根，购自四川；藁本为伞形科植物藁本LigusticumsinensisOliv的干燥根茎，购自四川；川芎为伞形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort的干燥根茎，购自四川；细辛为马兜铃科植物北细辛AsarumheterotropoidesFr.SChmidtvar.mandshuricum(Maxim)Kitag.干燥根及根茎，购自辽宁辽中；羌活为伞形科植物羌活NotopterygiumincisumTingexH.T.Chang的干燥根茎及根，购自四川资阳；甘草为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch的干燥根及根茎，购自甘肃。以上药材均经南京中医药大学中药鉴定学教研室王春根教授鉴定。

1.3试剂

乙醚（南京试剂厂批号050107）；鸡红细胞（新鲜公鸡血，用生理盐水洗涤后备用）；氯化钠（太仓化工厂批号050722）；苦味酸（上海化学试剂药品供应站批号040221）；鸡胆（9~11日龄，南京中牧股份药械厂）。

1.4阳性对照

利巴韦林片（四川美大康药业股份有限公司，批号051101）。

1.5实验用病毒

甲型流感病毒A/PR8/34（H1N1），由中国预防医学实验室病毒研究所提供。

1.6实验动物

ICR小鼠(由南京中医药大学实验动物中心提供，合格证：苏动质97003)，随机分组，分笼饲养，自由饮水，喂全价颗粒饲料，室温22±2℃，湿度55%~65%。

2实验方法

2.1供试液的制备

2.1.1挥发油溶液的制备（I组~II组）

（1）混合挥发油（1）（I）：取苍术、白芷、川芎、藁本、羌活、细辛（过20目筛）按比例混合，共100g，按照《中国药典》2005年版一部附录XD挥发油测定法提取7h，提取后得到挥发油，用5‰CNC-Na配成每1mL含生药0.4g的混悬液。

（2）混合挥发油（2）（II）：苍术、白芷、川芎、藁本、羌活、细辛（过20目筛）各50g，按照《中国药典》2005年版一部附录XD挥发油测定法分别提取7h，提得的挥发油按比例混合，再用5‰CNC-Na配成每1mL含生药0.4g混悬液。

2.1.2油水混合液的制备（III组~V组）

（1）油水混合液（1）（III）：将混合挥发油组II与六味药材的水提混合液（取各药材提取挥发油后的水煎液，离心，取上清液，按比例混合，浓缩）混合，用5‰CNC-Na配成每1mL含生药0.4g混悬液。

（2）油水混合液（2）（IV）：将混合挥发油组II与六味药材混合水提液（取混合药材提取挥发油后的水煎液，离心，取上清液，浓缩）混合，用5‰CNC-Na配成每1mL含生药0.4g混悬液。

（3）油水混合液（3）（V）：将混合挥发油组I与六味药材混合水提液混合，用5‰CNC-Na配成每1mL含生药0.4g混悬液。

2.1.3水提液的制备（VI组~XI组）

（1）白芷去油水提液（VI）：除去挥发油的白芷水煎液，过滤，浓缩，浓缩液用5‰CNC-Na配成每1mL含生药012g混悬液。

（2）川芎去油水提液（VII）：除去挥发油的川芎水煎液，过滤，浓缩，浓缩液用5‰CNC-Na配成每1mL含生药012g混悬液。

（3）细辛去油水提液VIII：除去挥发油的细辛水煎液，过滤，浓缩，浓缩液用5‰CNC-Na配成每1mL含生药012g混悬液。

（4）羌活去油水提液（IX）：除去挥发油的羌活水煎液，过滤，浓缩，浓缩液用5‰CNC-Na配成每1mL含生药012g混悬液。

（5）苍术醇提药渣水提液（X）：取苍术药材80%醇提后的残渣，加8倍量水回流提取3次，每次2h，离心，合并上清液，浓缩。浓缩液用5‰CNC-Na配制成每1mL含药材0.034g的混悬液。

（6）藁本醇提药渣水提液（XI）：取藁本药材80%醇提后的残渣，加8倍量水回流提取3次，每次2h，离心，合并上清液，浓缩。浓缩液用5‰CNC-Na配制成每1mL含药材0.034g的混悬液。

2.1.4醇提液的制备（XII组~XVII组）

（1）白芷药渣醇提液（XII）：取去挥发油白芷的药渣加80%的乙醇提取3次，每次2h，合并醇提液，浓缩，浓缩液用5‰CNC-Na配成每1mL含生药0.12g混悬液。

（2）川芎药渣醇提液（XIII）：取去挥发油川芎的药渣加80%的乙醇提取3次，每次2h，合并醇提液，合并醇提液，浓缩，浓缩液用5‰CNC-Na配成每1mL含生药0.12g混悬液。

（3）细辛药渣醇提液（XIV）：取去挥发油细辛的药渣加80%的乙醇，提取3次，每次2h，合并醇提液，浓缩成每1mL含生药0.12g混悬液。

（4）羌活药渣醇提液（XV）：取去挥发油羌活的药渣加80%的乙醇提取3次，每次2h，合并醇提液，合并醇提液，浓缩，浓缩液用5‰CNC-Na配成每1mL含生药0.12g混悬液。

（5）苍术药材醇提液（XVI）：取苍术粉末（过20目筛）30g，用80%乙醇溶液在80℃水浴上回流提取3次，每次2h，合并滤液，浓缩。浓缩液用CNC-Na配制成每1mL含药材0.034g的混悬液。

（6）藁本药材醇提液（XVII）：取藁本粉末（过20目筛）30g，用80%乙醇溶液在80℃水浴上回流提取提取3次，每次2h，合并滤液，浓缩。浓缩液用CNC-Na配制成每1mL含药材0.034g的混悬液。

2.1.5超临界提取液的制备（XVIII组~XIX组）

（1）超临界提取液（1）（XVIII）：将苍术、川芎、白芷、细辛、藁本、羌活六味药材粉末（过20目筛）按处方比例混合，共200g，以95%乙醇为夹带剂，在萃取压力25MPa，萃取温度45℃，分离Ⅰ温度为40℃，分离Ⅱ温度为35℃条件下，萃取4h，提取物用5‰CNC-Na配成每1mL含生药0.4g混悬液。

（2）超临界提取液（2）（XIX）：将上述六味药材混合超临界提取物，按处方比例加甘草80%醇提取物（80℃水浴上回流提取，固液比为1∶8，分3次提取，每次2h，合并滤液，滤液浓缩，即得），用5‰CNC-Na配成每1mL含生药0.44g混悬液。

2.2甲型流感病毒鸡胚增毒实验

取9日龄鸡胚，参照鸡蛋上标记气室，放置于无菌净化台内，用75%乙醇和2%碘酊分别消毒2次，用无菌砂轮轻轻于气室隔膜处磨一小口，约0.05cm直径大小（针尖大小）。取甲型流感病毒（粉状），分次加入生理盐水0.3mL，混匀后，吸出至无菌试管内，稀释至2mL，吹打后，每只鸡胚接种0.2mL甲型流感病毒液，置37℃恒温箱孵养72h。以上9日龄鸡胚培养72h后，放入4℃冰箱，使血管内血液凝固，次日取出，置超净台内，用75%乙醇和2%碘酊分别消毒后，用无菌镊子除去封口处石蜡，用镊子除去气室及隔膜层，用无菌吸管轻轻吸去尿囊液（弃去浑浊尿囊液），以上收集为增毒一次的尿囊液，以上实验重复3次后，用于实验，实验前做血凝实验。

2.3血凝试验

取24孔板，每孔加入生理盐水0.5mL（除第1孔加入生理盐水0.9mL），将尿囊液编号（以每只鸡胚），取尿囊液0.1mL加入第1管内，混合后取出0.5mL加入第2管依次稀释至第8管，第9管不加病毒，作空白对照（生理盐水），随后，取新鲜公鸡血，用生理盐水洗涤3次后，配成0.5%鸡红细胞生理盐水溶液，加入0.25mL轻轻摇匀后，置室温放置2h后观察记录。血凝试验（HA）为640以上用于体内感染小鼠。

2.4甲型流感病毒感染小鼠半数死亡（LD50）滴定

取ICR小鼠56只，体重13~16g，雌雄各半，随机分7组，每组8只，取增毒3次的病毒尿囊液，以10倍稀释，每组滴一个病毒浓度，各组小鼠在乙醚浅麻醉下以血凝滴度为640病毒尿囊液50μL滴鼻感染小鼠，观察14d内死亡数，按Reed-Muench法计算，结果甲型流感病毒的LD50为10-1.71（表1）。

2.5对甲型流感病毒感染小鼠死亡的保护实验

取ICR小鼠288只，体重13~16g，雌雄各半，随机分18组，每组16只（见表1）。空白对照组：等量生理盐水10mL•kg-1；病毒对照组：等量生理盐水10mL•kg-1；利巴韦林组：50mg•kg-1；药物组分组及剂量见表1。以上各组动物均灌胃给药，给药剂量10mL•kg-1，1次/d×5d，于给药次日，各组小鼠在乙醚浅麻醉下，以血凝滴度640以上的尿囊液给小鼠滴鼻感染，每鼠50mL，观察动物感染后发病情况及死亡数目，记录14d死亡数，并进行组内比较存活天数和存活率。

3结果与讨论

（1）神术散提取物对甲型流感病毒（A/PR8/34）感染小鼠死亡的保护的实验结果见表2。表2神术散提取物对甲型流感病毒（A/PR8/34）感染小鼠死亡的保护作用

（2）由表2可见，神术散方不同提取物有不同程度的减少甲型流感病毒(A/PR8/34)感染小鼠死亡数，延长甲型流感病毒感染小鼠存活天数，除I、II、V、X无统计学意义外，其余各组与病毒模型组比较均有显著性差异（P

（3）本实验表明，神术散方中抗病毒药效物质呈多部位和多成分性，组成药味具有较好的互补性，醇溶性明显好于挥发油，方中各单味药的醇提液均明显减少甲型流感病毒感染小鼠死亡数，保护率介于43.75%~50%之间。提示原方不用汤剂而以散剂入药有其科学合理性。（4）超临界CO2萃取法为复方有效成分提取的新方法。由于其萃取温度低，尤其适合受热易氧化分解成分的萃取。本实验表明加减甘草醇提物神术散方超临界提取液具有延长甲型流感病毒感染小鼠存活天数，其保护率分别为50%和43.75%。而混合挥发油和油水混合液的保护率均大大低于超临界提取液，提示超临界CO2萃取法对抗病毒成分具有很好的溶解性，其挥发油成分基本没有破坏，是神术散方精制的首选方法。

参考文献：

［1］彭怀仁，项平主编.中医方剂大辞典［M］.北京：人民卫生出版社，1999，7：1437-1437.［2］宋•陈承，裴宗元，陈师文，等校；鲁兆麟主校；彭建中，魏富有点校.太平惠民和剂局方［M］.沈阳：辽宁科学技术出版社，1997：20-20.

［3］陈奇.中药药理研究方法学［M］.北京：人民卫生出版社，2000：251，275-276.

［4］刘劲松，齐方埠，贺蕊，等.荆防口服液抗病毒作用的研究［J］.中药新药与临床，1998，14（1）：41-43.

［5］李影林.中华医学检验全书［M］.北京：人民卫生出版社，1996：1683-1883.

［6］朱萱萱，徐力，方泰惠.肺毒清抗菌抗病毒实验研究［J］.中药新药与临床药理，2001，（12）4：263-264.

［7］徐叔云.药理实验方法学［M］.第三版.北京：人民卫生出版社，2002：1723-1724.