紫菜叶绿素铜钠盐的制备及其稳定性研究

【前言】紫菜叶绿素铜钠盐的制备及其稳定性研究由文秘帮小编整理而成，但愿对你的学习工作带来帮助。1 材料与方法 1.1 材料与仪器 紫菜购于福建省厦门市集美区石鼓路菜市场。主要试剂硫酸铜、氢氧化钠、盐酸、乙醇、丙酮、硫酸铜晶体（CuSO4·5H2O）均为分析纯；食盐、白砂糖、淀粉均为食品级。 主要仪器与设备有723PC紫外可见分光光度计（美国BECKMAN公司）、pH 211酸...

摘要：以紫菜为主要原料制备叶绿素铜钠盐，设计单因素试验和正交试验等优化叶绿素铜代反应条件及皂化条件，并对紫菜叶绿素铜钠盐的稳定性进行研究。结果表明，紫菜叶绿素铜钠盐制备的最佳工艺条件为叶绿素铜化时间12 h、浸提温度50 ℃、浸提时间2 h，丙酮与乙醇体积比6∶4的混合液作浸提液溶剂，液料比V溶剂∶m紫菜=60∶1 （mL/g）；皂化温度60 ℃、皂化时间40 min以上、皂化液pH 11.51～11.93。稳定性试验表明紫菜叶绿素铜钠盐耐光性较差，在室温、pH 8～12时稳定性较好，高于80 ℃的温度和强酸强碱会导致紫菜叶绿素铜钠盐变性，食盐、白砂糖、淀粉等常见食品添加剂对其无不良影响。

关键词：紫菜；叶绿素铜钠盐；制备；稳定性

中图分类号：TS264.4；S985.4+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）03-0639-06

叶绿素是常用的天然色素之一[1]，除被广泛用作食品、化妆品的着色剂与脱臭剂外，还因其具有抗诱变、抗氧化等活性[2]，在医药上可被用来治疗传染性肝炎、胃及十二指肠溃疡、慢性肾炎及急性胰腺炎，增进造血机能及促进放射线损害机体的康复[3-7]。生活在海洋中的藻类由于水中可被利用的光能比陆地上少得多，要完成能量的转移必须增加参与光合作用的叶绿素的含量[8]，所以海洋植物中叶绿素含量常常高于陆生植物。从理论上来说利用海洋植物来提取叶绿素，可以获得较高的提取效率。由于天然叶绿素遇热、光、酸、碱等易分解，且不溶于水，故不易保存，应用受限。近年来对天然叶绿素进行改性使其变成稳定的金属卟啉结构倍受关注，改性后的叶绿素铜钠盐是其金属卟啉结构中最重要的种类之一，基本原理是叶绿素分子中的Mg在酸性条件下被Cu取代，生成叶绿素铜代盐，叶绿素铜代盐在碱性条件下经过皂化生成叶绿素铜钠盐。叶绿素铜钠盐具有很高的稳定性，是一种安全无毒、水溶性好的天然食用色素[3]，除具有叶绿素的用途外，还可作光电转换材料等[9]。

本研究以紫菜为主要原料，以丙酮—乙醇混合溶剂为提取剂，采用溶剂浸提法提取叶绿素[10]，制备叶绿素铜钠盐，并对其稳定性进行研究，以期为海洋资源的综合利用和天然叶绿素产品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫菜购于福建省厦门市集美区石鼓路菜市场。主要试剂硫酸铜、氢氧化钠、盐酸、乙醇、丙酮、硫酸铜晶体（CuSO4·5H2O）均为分析纯；食盐、白砂糖、淀粉均为食品级。

主要仪器与设备有723PC紫外可见分光光度计（美国BECKMAN公司）、pH 211酸度计（北京哈纳科仪科技有限公司）、RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、HH-6数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）、DHG-9146A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏试验设备有限公司）、FA1004电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）、KQ5200D数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、FW100高速万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 紫菜叶绿素铜钠盐的制备方法 称取2.0 g紫菜于试管中，用50 g/L CuSO4溶液（pH 3.51）铜化12 h后洗涤脱水于锥形瓶中，加入丙酮—乙醇混合液（V丙酮∶V乙醇=6∶4）120 mL，在室温下浸提2 h，过滤得紫菜叶绿素铜代盐的浸提液。浸提液浓缩后加入50 g/L氢氧化钠溶液，调pH为11.51～11.93，在60 ℃水浴锅中加热回流皂化40 min以上，用石油醚萃取后静置分层，将萃取后的叶绿素铜钠盐于水浴锅中浓缩成盐，干燥后得到墨绿色带金属光泽的叶绿素铜钠盐。

叶绿素铜钠盐得率=紫菜叶绿素铜钠盐粗产品质量/紫菜质量×100%

1.2.2 紫菜叶绿素铜代盐和铜钠盐吸收光谱图的绘制 ①紫菜叶绿素铜代盐的吸收光谱图。用移液枪吸取1 mL紫菜叶绿素铜代盐浸提液于10 mL的容量瓶中，用丙酮—乙醇混合溶剂（V丙酮∶V乙醇=6∶4）稀释至刻度，并以此溶剂作参比，用紫外可见分光光度计在360～680 nm波长范围内扫描。②紫菜叶绿素铜钠盐的吸收光谱图。取叶绿素铜钠盐粗品0.1 g加蒸馏水溶解，移入100 mL容量瓶中用蒸馏水定容，再分别取1、2、3 mL用蒸馏水定容于10 mL容量瓶中，以蒸馏水作参比，用紫外可见分光光度计在360～680 nm波长范围内扫描。

1.2.3 紫菜叶绿素铜代盐制备条件的优化 ①浸提溶剂。分别以95%乙醇（体积分数，下同）、95%丙酮、95%甲醇、丙酮—乙醇混合液（V丙酮∶V乙醇=95∶5）为浸提溶剂，按试验方法制备紫菜叶绿素铜代盐浸提液。②浸提溶剂丙酮—乙醇混合液体积比。分别按V丙酮∶V乙醇=1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1配制丙酮—乙醇混合液作为浸提溶剂，制备紫菜叶绿素铜代盐浸提液。③铜化时间。铜化时间分别为9、10、11、12、13、14 h，按试验方法制备紫菜叶绿素铜代盐浸提液。④铜化液pH。铜化液pH分别为2.02、2.52、3.06、3.51，其中3.51为未加酸铜化液的pH，按试验方法制备紫菜叶绿素铜代盐浸提液。⑤浸提时间。浸提时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，按试验方法制备紫菜叶绿素铜代盐浸提液。⑥液料比（V溶剂∶m紫菜，mL/g，下同）。分别按V溶剂∶m紫菜=30∶l、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1添加溶剂，按试验方法制备紫菜叶绿素铜代盐浸提液。⑦浸提温度。分别在25（室温）、30、35、40、45、50、55 ℃的浸提温度下按试验方法制备紫菜叶绿素铜代盐浸提液。⑧正交试验。根据单因素研究结果，选择对叶绿素铜代盐制备影响较大的因素设计正交试验，优化叶绿素铜化条件。

1.2.4 紫菜叶绿素铜钠盐皂化条件的优化 ①温度和时间对叶绿素铜钠盐皂化效果的影响。调滤液pH为11.85，在60 ℃和70 ℃下皂化不同时间（20、40、60、80、100 min），用石油醚萃取未被皂化的物质，观察萃取液和浓缩液的颜色和分层情况。②pH对叶绿素铜钠盐皂化效果的影响。将浓缩液用NaOH溶液调至不同的pH，在60 ℃下皂化40 min，用石油醚萃取不皂化物质，观察分层情况和石油醚层的颜色。

1.2.5 紫菜叶绿素铜钠盐的稳定性研究 取制备的叶绿素铜钠盐0.1 g用蒸馏水定容至1 L，配成0.1g/L的溶液，分别测定其在不同光照、pH、温度和添加食品添加剂条件下的稳定性。①紫菜叶绿素铜钠盐的耐光性。取叶绿素铜钠盐溶液，分别在暗处与可见光下保存，每隔2 h测A405.1 nm。②紫菜叶绿素铜钠盐在不同pH下的稳定性。取叶绿素铜钠盐溶液，用盐酸和氢氧化钠溶液调成不同的pH，静置2 h后测定A405.1 nm。③紫菜叶绿素铜钠盐的耐热性。取叶绿素铜钠盐溶液在不同温度的水浴锅中保温40 min后冷却，观察溶液的颜色变化并测定A405.1 nm。④常见食品添加剂的影响。取叶绿素铜钠盐溶液，分别加入不同浓度的常见食品添加剂白砂糖、食盐、淀粉溶液，静置2 h，观察溶液的颜色变化并测定溶液在A405.1 nm。

2 结果与分析

2.1 吸收光谱图绘制

2.1.1 紫菜叶绿素铜代盐吸收光谱图 按试验方法，用紫外可见分光光度计测定紫菜叶绿素铜代盐浸提液在360～680 nm波长范围内的吸光度，结果如图1。由图1可以看出，浸提液吸光度在420 nm和650 nm处有两个波峰，由于浸提液中存在蛋白质、叶黄素、类胡萝卜素等杂质，其最大吸收峰接近408 nm[11]，因此试验以浸提液在650 nm处的吸光度表示其中叶绿素铜代盐的含量。

2.1.2 紫菜叶绿素铜钠盐吸收光谱图 用紫外可见分光光度计测定紫菜叶绿素铜钠盐水溶液在360～680 nm波长范围内的吸光度，结果如图2。由图2可以看出，紫菜叶绿素铜钠盐水溶液在380～680 nm有2个吸收峰，405.1 nm处的吸收峰为叶绿素铜钠盐所特有，而在630 nm处的吸收峰为叶绿素b特有，叶绿素铜钠盐的含量与紫菜中叶绿素b含量比值接近4∶1，符合《GB 3262-82食品添加剂 叶绿素铜钠盐》要求[12]，故在稳定性试验中采用405.1 nm波长处的吸光度表示溶液中叶绿素铜钠盐的含量。

2.2 紫菜叶绿素铜代盐制备条件的优化

2.2.1 浸提溶剂对叶绿素铜代反应的影响 使用不同浸提溶剂制备叶绿素铜代盐，结果见图3。由图3可以看出，丙酮—乙醇混合液（V丙酮∶V乙醇=95∶5）作为浸提溶剂时制备效果最好，浸提液的A650 nm最高，其次是95%的丙酮，95%的甲醇提取效果最差。因此，后续试验选用丙酮—乙醇混合液作为叶绿素浸提溶剂。

2.2.2 丙酮—乙醇溶剂的配比对叶绿素铜代反应的影响 使用按不同体积比混合配制的丙酮—乙醇溶剂制备叶绿素铜代盐，结果见图4。由图4可以看出，丙酮—乙醇溶剂中V丙酮∶V乙醇=6∶4时混合液浸提效果最好，V丙酮∶V乙醇过高或过低均会降低叶绿素铜代盐溶液的吸光度A650 nm。

2.2.3 铜化时间对叶绿素铜代反应的影响 铜化时间不同，制得的叶绿素铜代盐浸提液A650 nm变化情况见图5。由图5可以看出，叶绿素铜代盐浸提液的A650 nm随铜化时间的延长呈先上升后下降的趋势，铜化时间为12 h时A650 nm最高。

2.2.4 铜化液pH对叶绿素铜代反应的影响 在不同pH条件下制备叶绿素铜代盐，所得浸提液的A650 nm测定结果见图6。由图6可以看出，在酸性条件下，叶绿素铜代盐浸提液吸光度基本不变，与未加酸时的A650 nm无显著差异，故试验时不需要再对铜化液进行酸化处理。

2.2.5 浸提时间对叶绿素铜代反应的影响 浸提时间不同，制得的叶绿素铜代盐浸提液A650 nm见图7。由图7可以看出，浸提时间从0.5 h延长到1.5 h，浸提液的A650 nm升高，1.5～2.0 h时浸提液A650 nm趋于稳定，2.0 h后A650 nm随浸提时间的延长呈降低趋势，为使浸提充分，浸提时间为2.0 h较好。

2.2.6 液料比对叶绿素铜代反应的影响 由于液料比对浸提效果的影响单纯用吸光度来衡量不够全面，可选用整个溶液中所含吸光物质的量，即V×C来判断[1]。根据朗伯-比耳定律[13]，A=εbC，A与C成正比，故以T（A650 nm×浸提液体积V×10）来衡量不同液料比条件下铜代反应的效果。以不同的液料比制备叶绿素铜代盐，所得叶绿素铜代盐浸提液的T变化情况见图8。从图8可以看出，随着V溶剂∶m紫菜的增大，T呈先升高后下降的趋势，V溶剂∶m紫菜=60∶1（mL/g）时T最高。

2.2.7 浸提温度对叶绿素铜代反应的影响 在不同浸提温度下制备叶绿素铜代盐，所得浸提液的A650 nm见图9。从图9可以看出，在试验范围内浸提液的A650 nm随着浸提温度的升高而升高。考虑到叶绿素为热敏性物质，温度过高会引起其分解，同时考虑到丙酮的挥发性，所以浸提温度不宜过高，试验时选用50 ℃的浸提温度。

2.2.8 紫菜叶绿素铜代盐制备正交试验结果 选择对叶绿素铜代反应影响较大的4个因素，浸提温度、浸提时间、丙酮—乙醇混合溶剂配比（V丙酮∶V乙醇）和液料比（V溶剂∶m紫菜），设置四因素三水平正交试验，正交试验因素与水平见表1，正交试验结果见表2。为精确表示试验结果，表2中以T（A650 nm×浸提液体积V×10）表示浸提液中叶绿素铜代盐的含量。由极差分析可知，各因素对叶绿素铜代盐制备效果的影响由大到小依次为浸提温度、浸提时间、V溶剂∶m紫菜、V丙酮∶V乙醇，最佳试验组合为A3B2C2D2，即浸提温度50 ℃、浸提时间2.0 h、丙酮—乙醇溶剂中V丙酮∶V乙醇=6∶4、液料比V溶剂∶m紫菜=60∶1（mL/g）。在此条件下制备紫菜叶绿素铜代盐，测得浸提液的A650 nm为0.547，T为328.2，大于所有正交试验组合的T值，说明此优化条件可行。

2.3 皂化条件对紫菜叶绿素铜钠盐制备的影响

2.3.1 温度和时间对皂化效果的影响 按试验方法制备紫菜叶绿素铜钠盐，考察皂化温度与时间对皂化效果的影响。皂化后用石油醚萃取，静置分层。上层萃取液呈现黄色，是叶黄素、蜡质、甲醇、植物醇、胡萝卜素等脂溶性杂质，下层为深绿色的叶绿素铜钠盐皂化液，若上层全部变黄，下层全部为深绿色透明溶液，即分层清，表明皂化效果较好，紫菜叶绿素铜钠盐得率较高。在不同温度与时间条件下进行叶绿素铜钠盐的皂化，结果见表3。由表3可以看出，在温度60 ℃、皂化时间40 min以上时可以得到较好的皂化效果，皂化温度为70 ℃时易出现上层偏绿、分层不够清的现象。

2.3.2 pH对皂化效果的影响 在不同pH条件下进行皂化试验，结果见表4。由表4可以看出，皂化pH在11.51～11.93范围内效果较好，上层黄、分层清。皂化pH低于11.03时上层偏绿、分层不够清。因此，制备紫菜叶绿素铜钠盐时适宜的皂化条件为水浴温度60 ℃、pH 11.51～11.93、皂化时间长于40 min。按试验方法制取叶绿素铜钠盐，称重，叶绿素铜钠盐得率为9.79%。

2.4 叶绿素铜钠盐的稳定性

2.4.1 叶绿素铜钠盐的耐光性 叶绿素铜钠盐水溶液在暗处与可见光下分别放置不同时间，A405.1 nm随放置时间变化的结果见图10。由图10可以看出，叶绿素铜钠盐水溶液在暗处放置时A405.1 nm变化较小；而在光照下A405.1 nm随放置时间的延长而下降，损失较多，所以叶绿素铜钠盐应放在避光处保存。

2.4.2 pH对叶绿素铜钠盐稳定性的影响 改变叶绿素铜钠盐水溶液的pH后测定其A405.1 nm，结果见图11。试验过程中，pH由3升高到12，溶液均为澄清透明，并且A405.1 nm随着pH的增大而升高，溶液颜色加深；pH在8～12范围内A405.1 nm趋于稳定，说明叶绿素铜钠盐作为食品添加剂，在中性和弱碱性介质中是稳定的。试验中还发现叶绿素铜钠盐水溶液pH12时A405.1 nm下降幅度很大。说明叶绿素铜钠盐在强酸及强碱性条件下不稳定。

2.4.3 叶绿素铜钠盐的耐热性 叶绿素铜钠盐水溶液的A405.1 nm随水浴温度变化而变化的结果见图12。从图12可以看出，在26 ℃（室温）～80 ℃范围内叶绿素铜钠盐水溶液的A405.1 nm随着温度的升高略有减小，但变化幅度很小，说明叶绿素铜钠盐的耐热性较好。温度高于80 ℃时叶绿素铜钠盐水溶液的A405.1 nm下降幅度变大，保存率迅速下降，可见叶绿素铜钠盐不适宜在过高温度下保存。

2.4.4 常用食品添加剂对叶绿素铜钠盐稳定性的影响 分别向叶绿素铜钠盐水溶液中添加不同质量分数的食盐、白糖和淀粉，溶液的A405.1 nm测定结果见表5。加入食品添加剂后叶绿素铜钠盐水溶液的颜色均为亮绿色，A405.1 nm变化幅度很小，所以常用食品添加剂食盐、白砂糖及淀粉对叶绿素铜钠盐基本没有不良影响。

3 小结与讨论

通过单因素和正交试验发现紫菜中叶绿素铜钠盐制备的最佳工艺条件为叶绿素铜化时间12 h、浸提温度50 ℃、浸提时间2 h，丙酮与乙醇体积比6∶4的混合液作浸提溶剂，液料比V溶剂∶m紫菜=60∶1（mL/g）；皂化温度60 ℃、皂化时间40 min以上、皂化液pH 11.51～11.93。在此条件下制备的紫菜叶绿素铜钠盐得率为9.79%。

对叶绿素铜钠盐的稳定性进行检测，发现紫菜叶绿素铜钠盐耐光性较差，需在避光条件下保存；热稳定性较好，但温度高于80 ℃时会导致其变性；pH 8～12时稳定性较好，不耐强酸或强碱；食盐、白砂糖、淀粉等常见食品添加剂对其无不良影响。

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