光合细菌对农村污水诱发蚕豆微核的影响

摘要：为了研究光合细菌对农村污水诱发蚕豆根尖细胞微核的抑制效应，以不同浓度的光合细菌污水处理液浸种处理蚕豆根尖，制片观察分析其对根尖细胞的影响，并统计有丝分裂指数、微核率、微核指数和微核抑制率。结果表明，随着光合细菌原液体积分数的增加，有丝分裂指数增加，根尖微核率和微核指数降低，微核抑制率增加，染色体畸变减少。光合细菌通过代谢分解同化了农村污水中的有害物质，降低了污染物对蚕豆根尖染色体的遗传损伤，缓解了有害物质对蚕豆根尖有丝分裂的抑制，减少了微核的形成和染色体畸变的发生。

关键词：光合细菌；蚕豆；农村污水；微核；染色体畸变

中图分类号：X703 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）17-4029-03

Effects of Photosynthetic Bacteria on Vicia faba micronucleus Induced by Rural Sewage

LI Jin-zhe，HUANG Ya-qin，WANG Wei

（Department of Biotechnology， Xinyang College of Agriculture and Forestry， Xinyang 464000， Henan， China）

Abstract： To study the inhibitory effect of Photosynthetic bacteria on micronucleated cells of Vicia faba root tips induced by rural sewage， Vicia faba root tips were treated with different concentrations mixture of photosynthetic bacteria and sewage. The impact on root tip cells was analyzed by making temporary mounts， counting the mitotic index， micronucleus， micronucleus index and micronucleus inhibition rate. The results showed that when the volume fraction of liquid photosynthetic bacteria increased， the mitotic index and micronucleus inhibition rate increased， while the micronucleus and micronucleus index decreased. Photosynthetic bacteria reduced the genetic damage of chromosome， alleviated the inhibition effect on mitotic， lowered the formation of micronuclei and chromosome aberrations in root tip cells by decomposing the pollutants in rural sewage.

Key words： photosynthetic bacteria； Vicia faba； rural sewage； micronucleu； chromosomal aberrations

我国人多地少，土地资源的开发已接近极限，化肥、农药的施用成为提高土地产出的重要途径，然而农药和化肥的过量使用已经严重污染了水体和土壤，再加上家禽家畜粪便和生活垃圾的任意排放，农村环境日益恶化，这直接影响了农产品的产量和品质，对人类自身的健康也构成了严重威胁[1，2]。在污水处理上，光合细菌（PSB）已经被广泛应用[3，4]。它是自然界中重要的微生物类群，生命力极强，能将废水中的大分子有机物、氮磷营养盐、重金属、含硫化合物和其他污染物如亚硝胺降解为挥发酸、低糖、氨基酸等无毒小分子物质[5]。目前，利用光合细菌处理废水已成功投产[6]。然而，关于光合细菌对农村污水诱发蚕豆根尖细胞微核的生物学效应的研究报道很少。

蚕豆根尖细胞微核检测技术由于简便、重复性好、灵敏度高，已广泛用于水质的检测[7，8]，它能较准确地反映致突变因子对细胞的遗传毒害的大小，如果利用蚕豆微核试验来研究光合细菌对农村污水处理能力将更具有代表性。本试验利用光合细菌原液和农村污水培养处理蚕豆种子，研究了不同浓度的光合细菌原液对污水诱发的蚕豆根尖细胞微核以及有丝分裂、染色体构型的影响，为光合细菌应用于农村环境治理提供细胞遗传学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

蚕豆种子；光合细菌菌株（紫色非硫细菌），由重庆大学生物工程学院提供。

1.2 光合细菌原液的制备

无菌操作条件下，在50 mL锥形瓶中加入10 mL除去琼脂的液态Molisch培养液，挑取Molisch 琼脂培养基上的光合细菌（紫色非硫细菌）单菌落于其中培养，黑暗状态下28 ℃、180 r/min培养16～18 h，培养至微红色，然后在28 ℃下，3 000～4 000 lx光照条件下，按照10%的接种量先接种到装有90 mL去琼脂的Molisch液体培养基的100 mL锥形瓶中培养3～5 d，培养期间，每天晃动锥形瓶3～5次，培养至光合细菌菌液颜色呈深紫色且OD593 nm=3±0.1（或OD795 nm=3.5±0.1）时停止培养，置于4 ℃冰箱中备用。

1.3 根尖细胞的培养与处理

将蚕豆种子在水中浸泡24 h，待吸水膨胀后移到铺有2层湿润滤纸的培养皿中，置于25 ℃黑暗培养50 h，待根长至1～2 cm时，随机分成7组（每组20个蚕豆），即阴性对照组CK1（自来水）、阳性对照组CK2（农村污水）和5个试验组。试验组处理液由污水和光合细菌原液混合配制，其中光合细菌原液的体积分数分别为5%（A）、10%（B）、15%（C）、20%（D）和25%（E）。将7组蚕豆根尖分别用7种处理液浸根培养6 h，自来水冲洗，培养皿中自来水恢复培养24 h。分别剪取长1 cm左右的根尖在卡诺固定液中固定24 h，然后酸解、染色、制片、镜检。每个根尖观察1 000个细胞。

1.4 数据分析

计算蚕豆根尖细胞有丝分裂指数（MI）、微核率 （MNR）、微核指数和微核抑制率。用Origin7.5数据处理软件对试验数据进行差异显著性分析。

MI=（分裂期细胞数/观察细胞总数）×100%

MNR=（微核细胞数/观察细胞总数）×1 000‰

微核指数=样本微核率/阴性对照的微核率

微核抑制率=（阳性对照微核细胞数-样本微核细胞数/阳性对照微核细胞数）×100%

2 结果与分析

2.1 不同浓度的光合细菌污水处理液对蚕豆根尖细胞有丝分裂指数的影响

对不同浓度的光合细菌污水处理液处理后的蚕豆根尖细胞进行了镜检观察，结果表明，MI随光合细菌原液体积分数的增加而增加，分别为（3.41±0.24）%、（4.38±0.13）%、（4.87±0.16）%、（5.27±0.21）%、（5.52±0.26）%。与阳性对照组CK2的MI（2.13±0.11）%相比，A液处理MI增加最少，仅1.28个百分点；E液处理MI增加最多，达3.39个百分点。与阴性对照组CK1的MI（6.14±0.24）%相比，E液处理后MI降低最少（0.62个百分点），D液处理后MI降低0.87个百分点。由此可见，农村污水明显抑制了根尖细胞的有丝分裂，但随着光合细菌原液体积分数的增加抑制作用减弱，即MI与光合细菌原液体积分数之间呈正相关。

2.2 不同浓度的光合细菌污水处理液对蚕豆根尖细胞微核的影响

用含不同量光合细菌的污水处理浸种蚕豆根尖，通过制片观察微核的发生（图1），并统计MNR、微核指数和微核抑制率（表1）。如图1所示，在蚕豆根尖细胞的不同时期均观察到了微核的发生。在细胞间期观察到了多种微核类型，有单微核、双微核和大微核，其中单微核最常见，数量最多，双微核和大微核较少。在有丝分裂的过程中，也有微核的出现，即前期微核、后期微核和末期微核，其中后期微核和末期微核最常见。这可能与有丝分裂后期姊妹染色单体向两级移动的过程容易受到外界的干扰，出现染色体的断裂有关。这些断裂的染色体片段游离在细胞中形成了微核，随着细胞的有丝分裂结束，随机进入到子细胞中，形成间期微核。由表1可见，随着光合细菌原液体积分数增加，MNR和微核指数降低、微核抑制率升高。用A液处理时，MNR最高，微核指数最高，微核抑制率最低。用E液处理时，MNR最低，微核指数最低，微核抑制率最高。A液和E液相比，MNR、微核指数、微核抑制率均相差较大。方差分析显示，五个不同梯度的菌液均与阳性对照相比有差异，其中B液、C液、D液和E液均达到了极显著差异。因此，认为光合细菌能够抑制污水所诱发的微核的产生，随着光合细菌原液体积分数的增加，对微核的抑制效应越显著。光合细菌对污水诱发的微核的抑制作用与光合细菌原液的体积分数之间存在计量-效应关系，其相关方程式为y=0.352 057 x-3.302 06，式中，x代表光合细菌原液的体积分数（%），y代表微核抑制率（%），R2=0.956 1。推测是光合细菌分解了污水中的有害物质，减少了其对染色体的遗传损伤。

2.3 不同处理液下蚕豆根尖细胞染色体畸变情况

用含不同量光合细菌的污水处理浸种蚕豆根尖，观察细胞的有丝分裂，其间出现的染色体畸变主要有滞后染色体、染色体抛出、染色体桥、染色体环、三体和染色体断片，有的染色体畸变呈并发状（图2）。分析发现，阳性对照的根尖染色体畸变类型最多，且形式复杂，呈并发状。随着光合细菌原液体积分数的增加，染色体畸变减少，畸变类型单一化。染色体结构的变异主要表现是染色体抛出、染色体桥和染色体环；染色体行为变异的典型表现是染色体滞后；微核的诱发必然导致染色体数目的减少，产生非整倍体。随着光合细菌原液体积分数的增加，染色体畸变类型减少，染色体畸变率降低，两者呈负相关。

3 讨论

试验结果表明，光合细菌能够抑制农村污水对蚕豆根尖细胞的遗传毒害。随着光合细菌原液体积分数的增加，MI和微核抑制率增加，根尖MNR和微核指数降低，染色体畸变程度降低。当光合细菌原液的体积分数为25%时，有丝分裂指数最大、微核率最低、微核指数最小、微核抑制率最高、染色体畸变最少。可见，光合细菌通过代谢分解同化了农村污水中的有害物质，将农药和化肥的残留降解，从而降低了污染物对蚕豆根尖染色体的遗传损伤，缓解了有害物质对蚕豆根尖有丝分裂的抑制，减少了微核的形成和染色体畸变的发生。前人研究发现洋葱[9]和香菇[10]水提液能抑制环磷酰胺诱发的微核、蛹虫草水提取液能抑制Cu2+诱发的微核[11]、蛹虫草多糖能抑制紫外线诱发的微核[12]，而光合细菌对污水诱发的微核的抑制效应还未见报道。

光合细菌对污水诱发的微核的抑制作用与光合细菌原液的体积分数之间存在计量―效应关系，可以拟合出直线回归方程，可见体积分数与抑制率虽然呈正相关，但是此方程的R2=0.956 1

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