氯沙坦对血管性痴呆大鼠认知功能的改善及胆碱能系统活性的影响

[摘要] 目的 研究氯沙坦对血管性痴呆（VaD）大鼠认知功能的改善和胆碱能系统活性的影响。 方法 将40只雄性SD大鼠随机分成四组：假手术组，模型组，氯沙坦低剂量[2 mg/（kg・d）]组，氯沙坦高剂量[5 mg/（kg・d）]组，每组10只。用双侧颈总动脉永久性结扎法（2VO）制备VaD大鼠模型，造模前予灌胃治疗，Morris水迷宫测试治疗后VaD大鼠认知功能的改善情况，Tunel染色测定各组大鼠海马脑组织内细胞凋亡的变化。免疫组织化学方法检测Bc1-2、Bax蛋白表达，并测定乙酰胆碱转移酶（ChAT）活性。 结果 方差分析表明，潜伏期和跨越次数F值分别为33.23和25.20。氯沙坦灌胃治疗的VaD大鼠，与未予治疗的VaD大鼠组相比，治疗组大鼠找到平台的潜伏期缩短（P < 0.01），穿越平台次数增多（P < 0.01）；氯沙坦高剂量组较氯沙坦低剂量组逃避潜伏期时间减少，穿越平台次数增多（P < 0.01）。方差分析表明，凋亡细胞、Bcl-2蛋白及Bax蛋白F值分别为155.58、215.79和428.95。与模型组相比，氯沙坦治疗组大鼠脑组织海马区凋亡细胞数明显减少，抗凋亡基因Bcl-2蛋白表达显著增加，凋亡基因Bax蛋白表达降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；氯沙坦高剂量组与氯沙坦低剂量组相比，Bcl-2蛋白表达增加，Bax蛋白表达下降，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。方差分析表明，各组大鼠ChAT活力F值为13.61。氯沙坦治疗组脑组织ChAT活力明显升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；氯沙坦高剂量组与氯沙坦低剂量组相比，脑组织ChAT活力显著升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 氯沙坦治疗可以明显改善VaD大鼠的认知功能，其机制与调节凋亡相关蛋白的表达、促进乙酰胆碱的合成相关。

[关键词] 氯沙坦；血管性痴呆；认知功能；细胞凋亡；乙酰胆碱转移酶

[中图分类号] R749.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）01（a）-0010-04

血管性痴呆（vascular dementia，VaD）是由一系列脑血管因素（缺血或出血或急慢性缺氧性脑血管病等）导致脑组织损害，引起以认知功能障碍为特征的综合征[1-2]。有研究表明，脑内具有独立的肾素-血管紧张素系统（RAS），而RAS除调节血压和水电解质平衡外，还参与学习、记忆等认知功能的调节。氯沙坦属血管紧张素1型受体（AT1受体）阻滞药，通过阻滞AT1受体对抗AngⅡ的作用。有研究显示氯沙坦可进入脑组织，拮抗脑局部AT1受体，下调脑局部RAS系统的作用而产生脑保护[3-4]。本研究采用VaD模型大鼠，观察氯沙坦对VaD大鼠认知功能的改善作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 老龄健康雄性SD大鼠40只，月龄大于16个月，体重300～450 g，由中山大学北校区实验动物中心提供。

1.1.2 药物 氯沙坦（美国杭州默沙东公司生产，批号：H20030654）。

1.1.3 试剂 凋亡TUNEL试剂盒（美国ROSS公司），兔抗大鼠Bax多克隆抗体（美国Epitomics公司），兔抗大鼠BCl-2多克隆抗体（美国CST公司），乙酰胆碱转移酶（ChAT）测试盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 血管性痴呆大鼠模型的建立及分组处理

将雄性SD大鼠用10%水合氯醛（0.035 mL/10 g）腹腔注射麻醉后，分离双侧颈总动脉，并以“0”号丝线阻断血流20 min，可以观察到大鼠惊厥、呼吸深慢、心跳加快；同时在距鼠尾尖约1 cm处断尾，放血约0.3 mL。松开丝线扣恢复血流10 min后，再次阻断血流20 min，如此重复3次，第3次血流再灌注后观察30 min，如大鼠呼吸、心跳平稳，即可缝合皮肤，放回笼中正常饲养。其中假手术组仅分离双侧颈总动脉，套丝扣；但不阻断血流，尾部不放血，观察时间、饲养条件与模型组相同。

造模前大鼠随机分成四组，每组各10只：假手术组，模型组，氯沙坦低剂量[2 mg/（kg・d）]组，氯沙坦高剂量[5 mg/（kg・d）]组。手术当天提前2 h灌胃，直至术后15 d。在灌胃后30 d，分别对上述各组大鼠进行水迷宫试验，观察各组大鼠学习和记忆成绩。术中假手术组大鼠无死亡，其余各组各有1只大鼠死亡。

1.3 Morris水迷宫测试

1.3.1 定位航行试验 水温控制在25℃左右，每日上下午各4次，将大鼠面向池壁分四个象限放入水中，记录其在2 min内寻找到平台的时间（逃避潜伏期）。如果大鼠在2 min内未找到平台，则用手牵引其至平台上，让大鼠停留20 s，再放回笼中，其潜伏期算120 s。历时5 d。

1.3.2 空间探索试验 第6天撤除平台，将大鼠任选1个入水点放入，记录其2 min内跨越原平台位置的次数。

1.4 免疫组织化学法检测Bcl-2、Bax阳性细胞的表达

各组大鼠在行为测试完毕后以10%水合氯醛麻醉，立即开胸暴露心脏，左心室迅速插管至主动脉，同时剪开右心耳，灌注生理盐水100 mL，再灌注4%的多聚甲醛250 mL，速度先快后慢，至颈部非常僵硬为满意，迅速取脑并分离左侧海马区组织，4%多聚甲醛中浸置4～6 h，经乙醇常规脱水、二甲苯透明后，浸蜡包埋，5 μm厚切片，行免疫组化染色，严格按照说明操作。

1.5 氯沙坦对乙酰胆碱转移酶活力的影响

将上述各动物实验，选取6只不同剂量组的大鼠断头处死，制成10%的匀浆，采用相关试剂盒测定脑组织中ChAT的活力。

1.6 统计学方法

应用SPSS 17.0统计软件，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间的比较采用方差分析，两两比较采用q检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠Morris水迷宫实验结果比较

模型组所用逃避潜伏期时间明显长于假手术组、氯沙坦高剂量组及氯沙坦低剂量组，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。空间探索试验结果显示，氯沙坦高剂量组、低剂量组出现穿越平台次数均高于模型组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。氯沙坦高剂量组出现穿越平台次数高于氯沙坦低剂量组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。

2.2 氯沙坦对大鼠凋亡细胞、Bcl-2蛋白及Bax蛋白的影响

与假手术组比较，模型组凋亡基因Bax蛋白表达显著增加（P < 0.01），抗凋亡基因Bcl-2蛋白表达显著下降（P < 0.01）。与模型组比较，氯沙坦低剂量组、氯沙坦高剂量组抗凋亡基因Bcl-2蛋白表达显著增加（P < 0.01），凋亡基因Bax蛋白表达降低（P < 0.01）。说明氯沙坦可能通过影响凋亡相关蛋白的表达而发挥神经保护作用。氯沙坦高剂量组与低剂量组比较，Bcl-2蛋白表达增加，Bax蛋白表达下降，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表2。

2.3 氯沙坦对大鼠脑组织中胆碱乙酰转移酶活力的影响

与假手术组比较，模型组脑组织ChAT活力显著降低（P < 0.01），氯沙坦低、高剂量组脑组织ChAT活力明显升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。氯沙坦高剂量组与低剂量组比较，ChAT活力差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。

3 讨论

中枢胆碱能机制和缺血后迟发性神经元死亡（DND）引起的炎症反应、细胞凋亡是近年研究较为重视VaD的发生机制[5]。中枢胆碱能通路是构成学习记忆的主要通路，乙酰胆碱（ACh）是其中的重要神经递质，其浓度升高有利于学习记忆能力的恢复，降低则促进痴呆的发生[6]。脑缺血时胆碱能神经元退变，分解ACh增强，导致ACh浓度降低从而促进痴呆的发生。ChAT活性被视为胆碱能神经元最具体的指标，ChAT活性降低的程度以及由此产生的ACh水平下降的严重程度与认知能力下降密切相关，与年龄相关的认知功能障碍在动物大脑中表现出ChAT活性显著降低[7]。海马CA1区对脑缺血有选择易损性，海马神经元的凋亡丢失和缺血坏死影响了神经元突触的可塑性，影响了海马对信息的处理和传递，引起脑缺血后记忆认知功能损害。

近年的研究证实[8-10]，应用血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）或血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）阻断剂减少AngⅡ的生成或阻断其受体信号通路，能明显改善脑血流量和认知功能。Rozzini等[11]研究证实，卡托普利可以改善缺血性脑梗死患者的生活质量，提高其认知功能。推测其机制可能与卡托普利通过抑制脑源性AngⅡ的生成，间接提高脑组织ACh的浓度，从而改善认知功能有关。Moretti等[12]研究发现，脑室内注入烟碱类胆碱能受体拮抗剂美加明可破坏雄性SD大鼠的空间学习能力， 再注AngⅣ可使其受损的空间学习能力恢复正常。说明AngⅣ对学习记忆的修复作用与脑中的胆碱能系统相关。

在本实验中，采用氯沙坦对血管性痴呆大鼠进行治疗，可明显改善大鼠搜索平台的潜伏期和跨越平台的次数，改善大鼠学习记忆功能。在实验中，VaD模型组大鼠CA1区Bax高表达，Bcl-2低表达，凋亡细胞增多，证实了长期低灌注可使海马神经元凋亡，影响认知和记忆。氯沙坦低剂量组和高剂量组与模型组相比，均有Bcl-2的高表达，Bax的低表达，凋亡细胞也明显减少。说明氯沙坦能抑制海马神经元细胞的凋亡，达到保护神经元，改善VD大鼠学习记忆能力的效果，其机制与调节凋亡相关蛋白的表达相关。同时，氯沙坦可以有效提高ChAT活性，明显改善模型小鼠学习记忆能力，提示氯沙坦可促进ACh的合成，增加ACh与M受体的结合，这可能也是氯沙坦增强模型小鼠学习记忆功能的机制之一。

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（收稿日期：2013-10-28 本文编辑：张瑜杰）