纳米金颗粒/麦尔多拉蓝溶胶的合成及NADH传感器应用

1 引 言

脱氢酶是氧化还原酶中为数最多的一类酶，目前已知超过300种脱氢酶使用氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）作为辅酶。在这些酶和辅酶协同作用催化底物时，NAD+从底物接受电子被还原成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）。建立高灵敏度的方法检测NAD+的还原形式NADH，在生物过程分析和酶分析过程中具有重要意义[1,2]。但是，在中性条件下，NADH在裸电极上的直接氧化通常有较大的过电位。通常氧化还原媒介体（如甲苯胺兰[3]，亚甲基蓝[4]和麦尔多拉蓝（MDB）[5]）多作为电催化剂，催化NADH氧化。

金纳米粒子（AuNPs）与电极间形成的导电性通道能显著提高电极界面的电子转移速率。采用AuNPs修饰电极加速界面电子转移动力，降低NADH氧化的过电位的研究多有报道[2,6～8]。如果能够将AuNPs的导电性和电催化性质与氧化还原媒介体结合，协同的电催化效应能够明显降低过电位，并提高稳定性。本研究建立了简单制备新型AuNPs/Eastman AQ55D/MDB溶胶的方法。阳离子交换树脂Eastman AQ55D通过离子交换作用固定阳离子媒介体MDB，同时作为AuNPs的保护剂和稳定剂。制备的AuNPs/Eastman AQ55D/MDB溶胶直接滴涂到玻碳（GC）电极表面，作为NADH的传感器，显著降低了NADH的氧化电位，显现了较高的电催化活性。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂 JEOL 2010 TEM仪（日本电子株式会社），加速电压为200 kV。CHI660B 电化学仪（美国CH公司）和CHI832型电化学仪（上海辰华公司）。Eastman AQ55D阳离子交换树脂（Sigma公司）。吩噻嗪衍生物MDB，NADH，氯金酸和柠檬酸钠等试剂均为分析纯，实验所用水经Millipore MilliQ 纯化。磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7.0）。PBS的离子强度通过改变磷酸二氢钾和磷酸氢二钠的浓度（0.01, 0.05, 0.10和0.50 mol/L）调节。玻碳电极为工作电极，旋状铂丝为对电极，Ag/AgCl为参比电极。在实验前，通入高纯氮气至少30 min，得到氮气的饱和溶液。

2.2 AuNPs/Eastman AQ55D/MDB/GC修饰电极的制备 制备AuNPs/Eastman AQ55D/MDB溶胶：将20

SymbolmA@ L分散度为28%的Eastman AQ55D（AQ）加水稀释至5 mL后，边搅拌边加入10

SymbolmA@ L 0.01 mol/L MDB，100

SymbolmA@ L 0.01mol/L氯金酸，及足量1% NaBH4。AuNPs/AQ溶胶的制备与AuNPs/AQ/MDB基本相同，仅未在混合液中加入MDB。将玻碳电极用Al2O3粉抛光至镜面，经水冲洗，再依次用乙醇和水超声清洗。将5

SymbolmA@ L AuNPs/Eastman AQ55D/MDB溶胶滴加到处理好的玻碳电极表面，在4 ℃下干燥。

3 结果与讨论

3.1 形貌表征 向阳离子交换树脂（AQ）/MDB混合液中加入氯金酸和还原剂NaBH4，溶液的颜色逐渐变成紫红色，形成AuNPs。AuNPs分散性较好，尺寸约5 nm。在两个对照实验中，（1）溶液中加入MDB和氯金酸，未加入聚合物AQ，带正电荷的MDB与带负电荷的氯金酸离子由于静电作用而形成沉淀；（2）溶液中加入AQ 和氯金酸，未加入MDB，氯金酸在硼氢化钠的还原作用下仍可形成金纳米粒子溶胶。结果表明，阳离子交换树脂AQ也可作为金纳米粒子的分散剂。AuNPs/Eastman AQ55D/MDB溶胶放置数月未生成沉淀，表明用AQ作为AuNPs分散剂制备的溶胶稳定性很好。

3.2 修饰电极的电化学性质 该复合膜修饰电极在PBS （pH 7.0）中的循环伏安图处在－0.15 V出现一对明显的氧化还原峰，对应MDB的氧化还原[5]。此修饰电极在所有的扫速范围内呈现了可逆的表面氧化还原电化学（峰峰电位差很小）。实验表明， 其氧化电流和还原电流分别与扫描速度呈现良好的线性关系，其电位几乎与扫描速度无关，在所有的扫描速度范围内氧化峰电流与还原峰电流的比率始终没有变化，说明AuNPs/Eastman AQ55D/MDB复合膜中MDB的电化学行为是快速的表面控制的电子传递过程。在－0.5～0.1 V范围内连续扫描1 h，此修饰电极的稳定性较好。

3.3 修饰电极对NADH氧化的电催化活性 AuNPs/AQ/GC修饰电极上NADH电化学氧化峰约为200 mV（图1C）。AQ/MDB/GC电极对NADH的电化学氧化峰约为－50 mV（图1B）。AuNPs/Eastman AQ55D/MDB/GC修饰电极的NADH氧化峰电位与图1B相比略有降低，但是差别不大，电流明显增加（图1A）。以上结果表明：AuNPs和MDB之间存在协同电催化效应，加入电子导体AuNPs，加快了MDB媒介的NADH氧化反应，引起了MDB氧化还原行为的增强，这可能是由于溶胶中掺杂的AuNPs具有较大的比表面积，使其在玻碳电极上形成的复合膜能够更快的进行物质扩散。AuNPs还具有较好的电导性和电催化性，可作为复合膜中MDB与电极之间的“桥梁”，从而加速了膜中的电荷传递,降低NADH在电极表面氧化过程的过电位。

[TS（][HT6SS]图1 AuNPs/Eastman AQ55D/MDB/GC修饰电极 （A），AQ/MDB/GC修饰电极（B）和AuNPs/AQ/GC修饰电极（C）电催化氧化NADH的循环伏安图（氮饱和PBS（pH 7.0），扫速200 mV/s）。a,b线分别是加入NADH前后的循环伏安图

Fig．1 Cyclic voltammograms of AuNPs/Eastman AQ55D（AQ）/Meldola′s blue （MDB）/GC electrode （A）, AQ/MDB/GC electrode （B） and AuNPs/AQ/GC electrode （C） in N2saturated PBS （pH 7.0）with scanning rate 200 mV/s: Curves a is in absence of NADH while curve b is in presence of NADH[HT5”SS][TS）]

本修饰电极对连续加入NADH响应的典型计时电流响应结果表明：NADH的检测线性范围为0.1～1.1 mmol/L，灵敏度为70 mA/（mol/L），检出限为0.02 mmol/L。在含有1.0 mmol/L NADH的PBS中连续扫描30 min后，相应的电化学信号基本保持不变。采用相同条件下制备的6支电极对1.0 mmol/L NADH进行检测，电化学信号的相对标准偏差为4.8%。将修饰电极贮存于4 ℃冰箱内，每天取出进行测量，30 d后，电化学信号仍然可以保持92.3%。

References

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Synthesis and Application Gold Nanopaticles/Meldola′s

Blue Colloids as NADH Biosensors

ZHANG XiaoHong1,CHEN LiBo2,WEI ZhongHang2

1（School of Pharmaceutical Sciences, Jilin University, Changchun 130021）

2（ChinaJapan Union Hospital of Jilin University, Changchun 130033）

Abstract This study reports a method for facile synthesis of gold nanoparticles/Eastman AQ55D/meldola′s blue （AuNPs/Eastman AQ55D/MDB） colloids. Cation exchange resin Eastman AQ55D can not only immobilize the redox mediator MDB by ion exchange interaction， but also serve as the protectant and stabilizer of AuNPs. Due to remarkable synergistic effect of AuNPs and MDB, the electrode modified with the AuNPs/Eastman AQ55D/MDB colloids apparently reduced the activation energy of Nico tina mideadenine dinucleotide （NADH） oxidation in the electrode surface. Chronoamperometry on NADH biosensor showed that the linear range for fast detection of NADH was 0.1 to 1.1 mmol/L and the sensitivity was 70 mA/（mol/L）. Facile synthesis of AuNPs/Eastman AQ55D/MDB composite films with high stability, high sensitivity and high reproducibility is promising for the reliable and durable NADH biosensors.

Keywords Gold nanoparticles; Meldola′ blue; Eastman AQ55D; Nicotinamideadenine dinucleotide

（Received 24 June 2011; accepted 26 August 2011）