黄花蒿多倍体的诱导与鉴定

摘要：利用秋水仙素，采用浸泡法和固体培养法分别对黄花蒿（Artemisia annua L.）丛生芽进行多倍体诱导，以期获得黄花蒿多倍体种质。结果表明，以5 000 mg/L秋水仙素浸泡丛生芽5 d处理获得的诱导效果最好，诱导率可达40 %。对性状变异明显的黄花蒿植株进行染色体数目观察，发现了黄花蒿四倍体和嵌合体。

关键词：黄花蒿（Artemisia annua L.）；多倍体诱导；组织培养；秋水仙素；染色体鉴定

中图分类号：S567.23+9.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）10-2591-04

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.10.035

Abstract： In order to obtain new polyploid germplasm of Artemisia annua L.， immersing and solid culture method with colchicines were used for polyploidy induction. The results showed that the buds immersed in 5 000 mg/L colchicine for 5 d had the highest polyploidy induction rate as 40%. Tetraploid and chimera plants were found by observing the chromosome numbers of A. annua polyploid plants with obvious phenotypic variances

Key words： Artemisia annua L.； polyploidy induction； tissue culture； colchicine； chromosome identification

黄花蒿（Artemisia annua L.）又名青蒿、臭蒿、香蒿、苦蒿，为菊科（Compositae）蒿属（Artemisia L.）一年生草本植物， 是传统中药，具有清热解暑，除蒸，截疟的功效，早在公元340年东晋医药学家葛洪《肘后备急方》中就有记载。黄花蒿作为重要的药用植物，是一种宝贵的生物资源，其分布极其广泛，是世界广布种，但世界上青蒿素类药物的原料80%～90%来自中国。黄花蒿中的主要成分青蒿素是一种具有过氧桥基的倍半萜内酯[1]，有速效和低副作用的抗疟性能[2]，是中国惟一进入美国药典（USP）、并作为国际惟一注册销售的源于传统中药且具有中国知识产权和国际专利的重要天然药品，同时也是被WHO推荐的首选基本目录药物，特别是对脑型疟疾和抗氯喹性疟疾有很好的疗效[3]。黄花蒿基因型较为丰富，在自然条件下相对比较难以实现优良基因资源的人工保存及其繁殖利用[4]；而组织培养技术则可以克服以上问题。利用秋水仙素结合组织培养诱导多倍体育种技术已经被广泛应用于多种植物上，如黄蝉兰[5]、桔梗[6]、甜叶菊[7]、鸡蛋参[8]等。国内外有关黄花蒿多倍体研究已有少许报道[9-11]，并取得了相似的试验结果，这表明在离体条件下利用秋水仙素诱导黄花蒿多倍体具有可行性，但未见生产应用的报道。试验以黄花蒿为材料，结合已有的黄花蒿组织培养技术[12-15]，通过秋水仙素诱导黄花蒿多倍体种质进行多倍体培养，以期为黄花蒿良种繁育工作提供理论依据和实践指导。

1 材料与方法

1.1 材料

试验以广西药用植物园科研基地种植的黄花蒿幼嫩枝条为供试活体材料。化学试剂主要有MS培养基（自配）、HgCl2、NaClO、6-BA（6-苄基氨基嘌呤）、NAA（萘乙酸）、秋水仙素、KT（6-糠氨基嘌呤）、IBA（吲哚丁酸）、高锰酸钾、甲醛、乙醇、对二氯苯、α-溴萘、卡诺固定液、苯酚品红、HCl、醋酸等。仪器主要有无菌接种箱、培养摇床、培养箱、冰箱、水浴锅、徕卡DM2500型双目生物显微镜、照相机等。

1.2 方法

1.2.1 培养条件 培养条件均为温度（25±2） ℃、光照度1 500～2 000 lx、光照时间12 h/d、相对空气湿度75%～85%。不定期用70%乙醇喷雾杀菌降尘，并定期用高锰酸钾和甲醛混合液对培养室进行密闭熏蒸消毒。

1.2.2 丛生芽培养 采用黄花蒿枝条中上部的嫩茎，用中性洗涤剂洗涮后，流水漂洗30 min，吸干水分，用0.05%升汞（HgCl2）灭菌5 min，再用饱和次氯酸钠（NaClO）灭菌15 min，然后用无菌水冲洗5次，切成1.5 cm 左右的茎段，接种于MS+0.05 mg/L的6-BA+0.01 mg/L的NAA培养基上，诱导丛生芽。

1.2.3 多倍体的诱导 ①浸泡法。将分化程度基本一致的黄花蒿丛生芽浸泡于浓度分别为500、1 000、2 500、5 000 mg/L的经过滤膜灭菌的无菌秋水仙素溶液中，并置于摇床上分别振荡培养2、3、4、5 d，转速为100 r/min。以不加秋水仙素溶液的材料为对照（也是分别振荡培养2、3、4、5 d），共20个处理。每个处理10个材料，重复3次。处理后用无菌水反复冲洗3～5次，并接种于MS基本培养基上。10 d后，将处理后仍成活的试管苗编号建立株系，接种于MS+1.0 mg/L的6-BA+0.2 mg/L的NAA+0.5 mg/L的KT继代增殖培养基上增殖培养，30 d后进行观察统计。②固体培养法。将分化程度基本一致的黄花蒿丛生芽接种于含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mg/L秋水仙素的MS基本培养基上培养30 d，以不加秋水仙素的材料为对照，共11个处理，每个处理30个材料，重复3次。将处理后仍成活的试管苗编号建立株系，用无菌水反复冲洗3～5次，并接种于MS+1.0 mg/L的6-BA+0.2 mg/L的NAA+0.5 mg/L的KT继代增殖培养基上增殖培养，30 d后进行观察统计。

1.2.4 生根培养 将浸泡法和固体培养法获得的各株系接种于MS+0.05 mg/L的IBA生根培养基上进行20 d生根培养，以诱导根系发生。

1.2.5 根尖染色体鉴定 常规制片，待生根苗根长至1.5～3.0 cm长时，于上午9：00～12：00的5个时段，分别在9：25、9：55、10：25、10：55和11：50各取性状明显有变异的黄花蒿根尖组织。①预处理，将约0.5 cm长的根尖组织放入饱和对二氯苯溶液中并置于4 ℃冰箱中整体处理5～6 h或放入α-溴萘中置于4 ℃冰箱中整体处理24 h，以积累分裂中期的细胞。然后用无菌水水洗，接着用预冷的卡诺固定液固定24 h后，置于70%乙醇中洗涤3～5次，并保存。②染色与压片：将保存于70%乙醇中的材料取出置于50%乙醇中3～5 min过渡，用无菌水冲洗3～4次后，在1 mol HCl中置于60 ℃水浴锅中恒温解离5～10 min，用无菌水冲洗至少10 min后，放入45%醋酸中软化5～10 min，然后用刀片将解离材料的根尖部分切下，置于载玻片上，加一小滴改良苯酚品红染色液，用镊子和解剖针将解离材料打成悬浮液，再加一小滴改良苯酚品红染色液，染色5 min后压片。③镜检：将做好的切片放于双目生物显微镜下观察染色体分散情况，记录并照相。

2 结果与分析

2.1 秋水仙素浸泡法诱导黄花蒿丛生芽多倍体

秋水仙素不同浓度溶液浸泡和不同处理时间对黄花蒿丛生芽诱导变异的影响情况见表1。由表1可以看出，秋水仙素对黄花蒿丛生芽的毒害程度与浸泡时间密切相关，随着处理时间的延长，试管苗丛生芽存活率降低，但其诱导率随之提高。秋水仙素浓度为0～500 mg/L时，黄花蒿的诱导率为0，为无效浓度。在1 000 mg/L秋水仙素处理4 d后，黄花蒿开始有变异现象出现。当秋水仙浓度提高到2 500 mg/L和5 000mg/L、处理4～5 d时，诱导率相对提高，但同时死亡率也相对增加。试验结果表明，用秋水仙素浸泡黄花蒿丛生芽，处理浓度为2 500 mg/L和5 000 mg/L、处理时间达到4～5 d时，诱导效果相对较好，其中以5 000 mg/L秋水仙素处理5 d的诱导效果最好，诱导率可达40%。

2.2 秋水仙素固体培养法诱导黄花蒿丛生芽多倍体

秋水仙素不同浓度加入到固体培养基后对黄花蒿丛生芽诱导变异的影响情况见表2。由表2可以看出，培养基中加入秋水仙素的处理，黄花蒿丛生芽均有变异产生。当培养基附加的秋水仙素浓度达到70 mg/L时，诱导效果较好，诱导率为13.33%；当秋水仙素浓度为100 mg/L时，黄花蒿的死亡率达到了76.67%，且出现了嵌合体。说明固体培养基添加秋水仙素后，当处理浓度为70 mg/L时，诱导效果较好，且死亡率相对较低。

2.3 生根培养

由MS+0.05 mg/L的IBA生根培养基经20 d生根培养后，固体培养基添加秋水仙素的处理仅有少量生根，而经秋水仙素浸泡法培养的黄花蒿丛生芽相对较易生根。

2.4 染色体鉴定结果

2.4.1 取材最佳时间 不同时间取材压片镜检的结果显示，在上午10∶25取材，用饱和对二氯苯预处理并置于4 ℃冰箱中6 h或者用α-溴萘预处理后置于4 ℃冰箱中整体处理24 h，解离8～9 min，解离后用45%的冰醋酸对材料进行处理可以达到较好的制片效果。

2.4.2 压片镜检的结果 随机取20株（浸泡法和固体培养法各10株）性状变异明显的黄花蒿材料进行染色体数目观察，以二倍体黄花蒿材料为对照。结果表明，黄花蒿二倍体染色体数目为2n=2x=18（图1），四倍体染色体数目为2n=4x=36（图2）。与二倍体相比，四倍体植物较为粗壮，叶片浓绿，变大（图3）。另外在固体培养法得到的部分性状明显变异植株中，同一根尖中发现了18条和36条染色体2种细胞并存的现象，初步判断其为嵌合体。

3 小结与讨论

试验以黄花蒿丛生芽为诱导材料，采用秋水仙素浸泡后培养、固体培养基添加秋水仙素相结合的诱导技术，探索黄花蒿多倍体诱导的有关参数，筛选出了组织培养诱导黄花蒿多倍体的最佳方法，即以5 000 mg/L秋水仙素浸泡丛生芽5 d的处理获得的诱导效果最好，诱导率可达40%，并成功获得了黄花蒿四倍体材料，为选育抗逆性强、产量高、青蒿素含量多的黄花蒿优质新品种提供了可行路径。

穆胜玉[11]报道的浸泡法虽然可以诱导得到多倍体，但发现该方法容易使材料缺氧，且对材料伤害比较直接。本试验在浸泡的基础上，使用了摇床进行振荡处理，增加材料与氧气接触的空间，以减少对材料的伤害，获得了较好的诱导效果。同时发现随着秋水仙素浓度的增加，黄花蒿多倍体诱导率随之提高，但其死亡率随之增加。固体培养法由于参试材料没有完全接触到秋水仙素，容易出现嵌合体；随着秋水仙素浓度的增加，黄花蒿死亡率也随之增加，这可能是间接导致诱导率随之降低的原因之一。

药用植物大多以根、茎和叶等器官为收获对象，其染色体加倍后，根、茎、叶巨型化，能大幅度提高以相应部位入药的药材产量，较好地满足了药材生产的要求；药用植物的倍性变化往往能导致次生代谢产物含量的变化，多倍体植株通常具有较高含量的活性成分，大多数多倍体中次生代谢产物的含量都有所增加，这就有可能获得有效成分含量高的药用植物新品种[16，17]。寻晓红等[9]和穆胜玉[11]研究发现，黄花蒿四倍体植株的营养体和花蕾比二倍体明显增大、增重，Jesus等[10]研究发现，四倍体的青蒿素含量比二倍体高很多，所以通过秋水仙素诱导黄花蒿四倍体可能将为选育抗逆性强、产量高、青蒿素含量多的黄花蒿优质新品种提供了一条新途径。

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