严重创伤后早期血液CD4+T细胞及其细胞因子的变化

【摘要】目的探讨创伤后早期患者血液中CD4+T细胞及其细胞因子的变化趋势。方法连续入选2009年9月至2011年11月在第九七医院住院的61例成年男性创伤患者。排除标准：①年龄小于18岁或大于75岁者。②伤后已输血者。③患有免疫系统疾病，肿瘤，糖尿病，近期有病毒、细菌、寄生虫感染病史者。④正在或近期使用免疫抑制剂、激素等药物者。以损伤严重度评分≥16分为严重损伤标准，将患者分成轻伤组和重伤组两组。17 例健康成人男性血样标本作为正常对照组。在入院当时抽取患者静脉血，采用流式细胞术检测外周血中CD3+、CD4+、CD8+ T细胞含量，采用酶联免疫吸附法检测血浆中TNF-α、INF-γ、IL-1、IL-4、IL-6及IL-12 水平，并计算Th1/Th2型细胞因子比值。使用SPSS 16.0统计软件进行统计学处理，两组间比较采用t检验，多组比较采用方差分析或秩和检验。以P

【关键词】严重创伤；CD4+T细胞；CD3+T细胞；CD8+T细胞；细胞因子；免疫；血液；早期诊断

Early changes of peripheral blood CD4+T cells and the related cytokines in patients with severe trauma HUA Rong*， CHEN Fu-xing， ZHANG Yong-mei， ZHOU Zhong-hai， WANG Shang-jing.*Department of Emergency Medicine， The 97th Hospital of PLA （HUA Rong）， Xuzhou 221002， China

Corresponding author： HUA Rong， Email： ilovezq@

【Abstract】ObjectiveTo investigate the early changes of CD4+T cells and the relevant cytokines in blood of patients with severe trauma. Methods Sixty-one consecutive patients with trauma admitted into the 97th Hospital of PLA from September 2009 to November 2011 were enrolled in this study. The exclusion criteria included： ① Patients were younger than 18 or older than 75 years. ②Patients received blood transfusion. ③Those suffered from immune system disorders， tumors or diabetes， or recent history of virus， bacteria or parasites infections. ④Those had current or recent treatment with corticosteroids or immunosuppressive drugs. According to ISS score≥16， there were 61 traumatic patients divided into mild trauma group and severe trauma group. Seventeen healthy volunteers were taken as control subjects. At admission， the peripheral venous blood samples of patients were taken to count the number of CD3+， CD4+， CD8+ T cells by flow cytometry and to detect TNF-α， INF-γ， IL-1， IL-4， IL-6 and IL-12 levels in plasma by enzyme linked immunosorbent assay， meanwhile the ratio of Th1 / Th2 type cytokine were calculated. Data were analyzed with t test and ANOVA or Kruskal-Wallis test by using SPSS version 16.0 package. P value < 0.05 was considered to be statistical significance. ResultsCompared with control group， mild trauma and severe trauma groups showed a similar decrease in number of CD3+ T cells， and severe trauma group showed a most significant decrease in number of CD4+T cells. Severe trauma group had a lower INF-γ level compared with control group； IL-1 level in both mild trauma and severe trauma groups were lower than that in the control group； INF-γ/ IL-6 in severe group was significantly lower than that in the mild group. However， INF-γ/ IL-6 in mild group was higher than that in the control group.ConclusionsThe early stage of severe trauma exhibits a significant decrease in number of both CD3+ and CD4+T cells， accompanied by a significant reduction in most of cytokines， and has a tendency of shift to Th2 type cytokine. Therefore， the changes of immune cells should be promptly and successively monitored after severe trauma.

【Key words】Severe trauma； CD4+T cell； CD3+T cell； CD8+T cell； Cytokine； Immune； Blood； Early diagnosis

严重外伤的发病率很高，即便进行了有效复苏和手术，仍有许多患者最终死于多脏器功能衰竭 （MOF） 或脓毒症等严重并发症[1]，其主要原因与创伤后免疫功能紊乱有关[2-3]。理论上，给予恰当的免疫治疗可降低病死率[4]。目前创伤后免疫治疗的效果仍不确定，其原因可能与对创伤后患者免疫功能的动态变化了解较少，临床缺乏有效的观察指标造成治疗时机和方法不当所致[3]。因此，研究创伤后早期的免疫应答对于评价损伤程度以及依据应答程度提供恰当的免疫治疗具有重要意义。

1资料与方法

1.1一般资料

2009年9月至2011 年11月收入第九七医院创伤中心的61例创伤患者被纳入此项研究。纳入标准为： 成年男性，外伤后4 h内入住急诊创伤病房[5]；病例排除标准：年龄小于18岁或大于75岁者[6]；伤后已输血者；患有免疫系统疾病、肿瘤、糖尿病者；近期有病毒、细菌、寄生虫感染病史者；正在或近期使用免疫抑制、激素等药物者。以损伤严重度评分（ISS）≥16分为严重损伤标准[7]，把患者分成轻伤组和重伤组两组。17 例健康体检成年男性血样标本作为正常对照组。

1.2观察指标及方法

（1） 血标本采集：在入院当时、手术和输血前采集血标本，立即置于内含肝素的无菌试管中。（2）外周血中CD3+、CD4+、CD8+ T细胞含量的测定：采用免洗法测定淋巴细胞亚群：取外周肝素抗凝血100 μL，加入含有抗人CD3-FITC、CD8-PE、抗人CD45-PerCP、抗人CD4-APC的混合流式细胞荧光标记抗体20 μL（BD公司，美国），室温避光孵育20 min，各加入溶血素2 mL，避光静置15 min，离心，PBS洗涤2遍，再以300 μL PBS混悬，上流式细胞仪（BD FACSCalibur，BD公司，美国）检测。采用cellQuest Pro软件进行分析。（3）血浆中细胞因子TNF-α、INF-γ、IL-1、IL-4、IL-6及IL-12 水平的测定：采用酶联免疫吸附法。将剩余血标本在4 ℃、2000 r/min 条件下离心10 min，血浆过滤、分量并保存于-70 ℃待测，3 d内统一按说明书（试剂盒购自R&D Systems公司，美国）检测。（4）Th1/ Th2型细胞因子比值计算：测得TNF-α、INF-γ、IL-4、IL-6实际水平，按公式INF-γ/IL-4，TNF-α/IL-4，INF-γ/IL-6，TNF-α/IL-6计算Th1/Th2型细胞因子比值。

1.3统计学方法

以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 16.0统计软件，两组间比较采用成组t检验，多组比较采用单因素方差分析或Kruskal-Wallis秩和检验（非正态分布和方差不齐时），以P

2结果

2.1一般情况

轻伤组34人，年龄19～56岁（平均46岁），ISS评分（8.44±3.20），受伤至入院时间0.5～4 h（平均1.3 h）；重伤组27人，年龄21～53岁（平均42岁），ISS评分（26.44±16.59），受伤至入院时间0.5～4 h（平均1.8 h）；两组间年龄、受伤至入院时间差异无统计学意义。健康对照组17例，年龄21～50岁（平均40岁）。

2.2CD3+、CD4+、CD8+ T细胞变化

重伤组与轻伤组CD3+ T细胞低于正常对照组，重伤组CD4+ T细胞低于正常对照组，CD8+ T细胞、CD4+/CD8+3组间差异无统计学意义（表1）。创伤后早期患者血浆中TNF-γ在3组之间差异无统计学意义；INF-γ在重伤组明显低于对照组；IL-1在轻伤组和重伤组均低于对照组；IL-4、IL-6、IL-12在轻伤组明显低于对照组，重伤组与对照组之间差异无统计学意义（表2）。 创伤后早期患者血浆中INF-γ/IL4，TNF-α/IL4，IL12/IL4各组之间无显著差异；INF-γ/IL-6重伤组明显低于轻伤组，而轻伤组明显高于对照组；TNF-α/IL-6轻伤组高于对照组（表3）。

讨论

创伤后早期的免疫应答影响创伤的预后[8-9]，研究创伤后早期患者血浆中免疫细胞和细胞因子的变化有助于指导免疫治疗的方法和时机、手术干预时机和手术方式的选择等[10] 。本研究中，创伤后早期患者血浆中T细胞总数即CD3+ T细胞数明显减少，可能与创伤导致T细胞凋亡有关[11]。根据细胞的功能以及膜表面的标志将淋巴细胞分为三个亚群：T细胞、B细胞和NK细胞，其中T细胞根据TCR又将其分为αβT细胞、γδT细胞和NKT细胞，在末梢血中主要为αβT细胞，它们又进一步分为CD4+辅T细胞（Th）、调节性T细胞和CD8+细胞毒T细胞。CD4+ T细胞具有辅助B细胞和巨噬细胞活化的功能，而CD8+ T细胞通过杀伤靶细胞发挥其免疫生物学效应。本研究中，在重伤组CD4+ T细胞减少、而CD8+ T细胞不减少，其原因可能与CD4+较CD8+细胞对创伤敏感有关[1]。初始CD4+ T细胞被称为Th0细胞，活化之后分化为具有不同功能的Th1、Th2和Th17等效应T细胞亚群。Th1主要分泌INF-γ、TNF-α和IL-2，Th2则主要分泌IL-4、IL-10和IL-6等。本研究中，INF-γ、IL-1、IL-4、IL-6、IL-12分别在轻伤组和重伤组中减少，推测原因可能与创伤早期CD4的活化被抑制[11]，或与CD4+ T细胞减少有关。

TNF-α是创伤后早期反应的细胞因子，其半衰期约20 min，尽管半衰期短，其仍可促使许多促炎和抗炎细胞因子的分泌。与文献报道一致[5]，本研究中创伤后早期TNF-α并不升高，其主要原因可能与创伤早期缺乏病原体模式分子（如LPS）和IL-1的刺激有关[5]。IL-1的半衰期仅6 min，其确切的分泌机制尚不清楚，LPS能够有效地诱导巨噬细胞分泌IL-1，在发生革兰氏阴性细菌感染时血液中IL-1明显升高；IL-1还能够直接作用于T细胞，辅助其活化，在启动适应性免疫应答、脓毒症和全身炎症反应综合征中起重要作用[5]。本试验中IL-1在创伤早期无明显升高，反而降低，其原因尚不清楚，可能与其半衰期较短或尚无微生物感染有关。

另一早期炎症反应的重要细胞因子是IL-6，它既是促炎介质又是抑炎介质。IL-6促使T细胞的增殖和分化，在宿主的防御反应中起重要作用。IL-6水平与Th2细胞反应有关[5]，其抑炎作用不能被其他抗炎因子取代[12]。多数作者认为，IL-6的水平与创伤的严重程度相关[13]。但其升高是否是导致MOF的原因还是MOF的标志尚不清楚[5，14]。本研究中，重伤组IL-6并未发现明显升高，可能与本组创伤的严重程度相对较低以及检测时间较早有关[5]。

IL-4是Th2型细胞因子，它下调Th1反应。抑制Th1细胞的分化可导致感染的播散和MOF[1]。IL-12是促使原始T细胞向Th1细胞分化的必须的细胞因子，是重要的免疫调节细胞因子，在免疫保护的过程中起重要作用[15]。INF-γ的产生依赖于IL-12的存在，反之INF-γ也促进IL-12的产生，形成正反馈，致IL-12明显升高[16]。本研究中，轻伤组IL-12虽然减少，但仍可使INF-γ维持在正常水平；重伤组即使IL-12无明显减少，但INF-γ明显减少，其原因尚不清楚，可能是重伤导致Th1细胞分泌促炎因子的能力下降[5]。

宿主的免疫保护主要依靠免疫细胞的内稳定以及各种免疫细胞分泌的细胞因子平衡[15]，严重创伤后就Th1和Th2型细胞因子的偏向有不同的报道，有的认为无偏移[2]，有的认为向Th2型偏移[17]。其原因可能与不同创伤类型中Th1和Th2细胞分化类型不同有关[1]，也可能与研究的样本构成不同有关，如女性对创伤的耐受性更强[18]，以及手术、输血对研究的结果影响较大[15]，创伤的不同时期免疫功能变化也不相同[19]，以上均可导致不同研究的结论也不尽相同。为此，本研究中排除了女性，并在手术和输血前抽血检测细胞数和细胞因子水平。创伤后的促炎与抑炎的动态平衡对于创伤后的神经内分泌系统、微循环、凝血和代谢均有重要影响，如平衡被破坏，当促炎细胞因子占优势时，则导致SIRS；当抗炎细胞因子占优势时则引起免疫抑制，表现为Th2型细胞因子占优势，而产生Th1型细胞因子的功能明显减退[20]，从而导致感染和脓毒症，两者均对创伤的恢复不利。本研究发现，在创伤后早期，轻伤组Th1、Th2细胞因子均下降，Th1/Th2型细胞因子比值略有增高，倾向Th1型；重伤组Th1细胞因子下降，Th2型细胞因子维持不变，虽然Th1/Th2的比值与健康对照组差异无统计学意义，但是有向Th2型偏移的趋势。然而，是否轻伤组易于发生SIRS，而重伤组易于发生免疫抑制尚需进一步研究。本研究提示，创伤后早期即存在免疫失衡的情况，不同伤情可能失衡的表现不同，由于手术、出血、输血、感染等“二次打击”均会进一步损伤免疫功能[21]，在进行免疫治疗时应根据具体情况制订治疗方案，同时，对于严重损伤者，在手术时应考虑术后发生免疫过度抑制的可能而进行干预性治疗。

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（收稿日期：2013-06-18）

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2013.12.026

基金项目：创新项目（09MA036）；江苏省麻醉学重点实验室开放课题 （KJS1103）

作者单位：221000江苏省徐州，中国人民第九七医院急诊科（花嵘，王尚静），生物治疗中心（陈复兴，周忠海）；徐州医学院麻醉生理学教研室（张咏梅）

通信作者： 花嵘，Email：

p1411-p1415