果蝇和蚤蝇体内细菌培养及相关研究

摘 要:探讨果蝇和蚤蝇体内细菌的相互拮抗作用。方法:通过细菌培养扩增,拮抗实验后在显微镜下观察其先后影响。结果与结论:蚤蝇体内细菌对果蝇体内的细菌发生互相抑制作用。

关键词:拮抗作用 细菌培养

中图分类号: Q93文献标识码:A 文章编号:1007-3973 (2010) 03-052-02

1前言

蝇类是昆虫界的一个大家族。果蝇和蚤蝇都是同一个家族中的成员,它们都具有体形小,行动快的特点。果蝇是高等真核生物遗传学研究的经典材料。比较果蝇的研究成果,对蚤蝇的研究还很不深入,为了对蚤蝇、果蝇有更深的了解,做了本次实验。

2材料与方法

2.1实验仪器及药品

水浴锅、电子天平、微量可调加样器、PH S-25数显PH计、80-2离心机、蒸馏水器、冰箱、凝胶成像系统、恒温摇床培养箱、细菌培养箱、微波炉、全自动高压灭菌锅、净化工作台、生物显微镜、Olympus照相机。

米勒-海顿琼脂(MHA)、蛋白胨、酵母提取物、碘液、结晶紫、95%酒精 、沙黄(或复红) 、去离子水。

2.2果蝇与蚤蝇的饲养方法

饲养蚤蝇的方法: 在自然界,蚤蝇常大量聚集在烂肉上,有Bacillus SK 的 Mill er Hinton II 培基一星期观察,有任何成长反应. 添加多样的维他命或者牛奶也无大帮助. 只Bacillus SK在LB.broth中繁殖后离心, 蒸馏水洗2次, 也能有疑问地支持蚤蝇从幼虫到成蝇完全的生.最好的繁殖方法: 牛肉炖汤(100克磨碎肉,100克 D-葡萄糖和 400 克 水焖 121C 三十分)掺Bacillus SK ,直到OD 0.3, 再培在 32℃恒温摇床培养箱,摇床24小.将这个broth分装入小瓶中. 每天加入果蝇培基 1.5 cc , 蚤蝇幼虫迅速成长。

饲养果蝇的方法:在自然界,果蝇常大量聚集在成熟且柔软的水果上,成虫及幼虫均以发酵、熟透的水果为食,所以活酵母菌是成虫食谱中的重要组成。所以,早期的实验室用熟透的香蕉加上酵母菌来饲养,现在已有各种不同配方的培养基。本次实验使用的培养基如下表:

配制时先将五分之四晦水放入锅内,再分放入适当的洋菜粉(食用)、砂糖及面包酵母,一边倒入一边搅拌。再将五分之一的水与玉米粉色,用全果实磨成,不至米淀粉混合均匀,倒入大锅一起煮。由于至米粉易粘在锅壁,煮成焦黑;所以,必一边加热一边搅拌,最好使用不沾锅及上有缝的铲子。沸腾后改用小火继续煮5至10分种,直到培养基成糊状为止。此时熄火,加入丙酸,充分搅拌,趁热立刻倒入经170℃、1小干热灭菌的平底小培养瓶或牛奶瓶中,并立刻塞上棉花塞。小瓶培养基高约1.5cm,牛奶瓶则近2cm。待瓶中水汽蒸蒸发干了,即可使用。未用完之培养基,可存于冰箱中,一周使用。

2.3制MHA培养基观察菌落及液体培养基(LB培养基)培养

2.3.1制MHA培养基观察菌落

取买来的米勒-海顿琼脂(MHA),在电子天平上称取17克,倒入1000 ml锥形瓶中,加入500 ml水,在电炉上微热使其溶解,贴好标签。将配好的培养基、接种枪,放入全自动高压灭菌锅内,在121℃灭菌25分钟,灭完菌取出,将培养基液体倒入培养皿中约1/3,待培养基凝固后,在净化工作台中接种。

取培养的果蝇和蚤蝇各3只,分别把3组进行不同处理,一组果蝇、蚤蝇(各1只)不用酒精处理,二组果蝇、蚤蝇(各1只)用酒精处理1分钟,三组果蝇、蚤蝇(各1只)用酒精处理5分钟,将处理完的菌种接种到培养基上,贴好标签。

将接种完毕的培养皿放在37℃培养箱中培养2天,2天后观察菌落(结果见图1)。

2.3.2液体培养基(LB培养基)培养及观察

在电子天平上依次称取:蛋白胨5g、酵母提取物5 g、NaCL10 g,倒入1000ml锥型瓶中,加入800ml去离子水,搅拌,使完全溶解,用5mol/L NaOH(约0.2ml),调节PH至7.4,加入去离子水至体积为1L。将配好的培养基、接种、锥型瓶100ml,放入全自动高压灭菌锅内,在121℃灭菌25分钟,灭完菌取出,在净化工作台中接种。将一步中培养出的不同处理过的单一菌种分别接种到锥型瓶中,封口贴上标签。将接完种的锥型瓶放入摇床培养箱中,摇床培养10小时,后显微镜观察。

对培养后细菌进行涂片并做革兰染色,油镜下观察玻片(结果见图二)。

2.4细菌抑制试验

2.4.1接种及观察

取液体培养基(LB培养基)培养出的菌种,取各种蚤蝇、果蝇培养液各加入3g蛋白胨,在电炉上微热使其全部溶解(温度过热会杀死培养液中细菌),凝固后倒置,放入培养皿中,在细菌培养箱中37℃培养1天。在净化工作台中,分别向蚤蝇培养基中部滴入一小滴果蝇的菌种,向果蝇培养基中部滴入一小滴蚤蝇的菌种,再在细菌培养箱中培养1天。

观察是否出现菌斑,如果出现菌斑说明一种细菌对另一种细菌没有强烈的互相抑制作用(结果见图三)。

3小结与分析

通过拮抗作用可以观察出蚤蝇体内细菌培养基接种果蝇体内的细菌(左图),果蝇菌落没有再生长;果蝇体内细菌培养基接种蚤蝇体内的细菌(右图),蚤蝇菌落也没有明显的生长。表明出蚤蝇体内细菌对果蝇体内的细菌发生互相抑制作用(结果见图三)。

4结论

细菌培养见图一,两种菌落都能在MHA培养基内很好生长。

拮抗作用实验结果见图三,表明这两种菌在对方培养基中都受到抑制,不能很好的生长繁殖,特别是占绝对优势的菌落对细菌有明显的生物拮抗作用。这种拮抗作用体现在:(1)改变pH,降低环境中的pH与氧化还原电势,从而抑制外来菌的生长繁殖;(2)占位性保护作用,菌落与培养基形成一层生物膜,阻止外来的菌落定植;(3)争夺营养,菌群由于数量大,在营养的争夺中处于优势。

参考文献:

[1]刘广纯.中国蚤蝇分类研究[D].西北农业大学(Ph.D 论文),1993.

[2]萨姆布鲁克J., 弗里奇 E. F., 曼尼阿蒂斯.分子克隆实验 指南[M]. 北京:科学出版社. 1993.

[3]奥斯伯 F., 布伦特 R., 金斯顿 R. E., 等. 精编分子生物学实验指南[M]. 北京:科学出版社, 1999.

[4]陶希.昆虫类分科之检索[M]. 台湾商务印书图书馆,1969.

[5]贡绅.昆虫学(上中下册)[R].中兴大学学农学院出版委员会,1978 .

[6]王振东,刘玉乐,田波. 一种改进的快速高效DNA回收法[J]. 微生物学通报,1994, 21(2): 120~122.

[7]刘广纯,陈琳,何小慧,邓理.东亚异蚤蝇生活史研究[J].沈阳大学学报,2001,13(2):1-2.

[8]Barnes, J.K. 1990. First record genus Phymatopterella in the Nearctic Region anddescription of P. ovatimacula,a new hump backed fly from Florida (Diptera: Phoridae). FloridaEnt. 73(4): 644-649.