鸡源沙门氏菌的分离鉴定及耐药性检测

摘 要：鸡是沙门氏菌最大的宿主。致病性鸡沙门氏菌已成为危害鸡场的一类重要传染性病原菌之一，同时抗生素的不合理使用，造成选择性压力下的鸡沙门氏菌耐药性不断增强。本试验旨在对广西部分市县的病死鸡只进行沙门氏菌的分离培养鉴定，并对分离株进行耐药检测，从而为发病地区提供当前流行的鸡沙门氏菌病的合理用药以及流行性监测，为鸡场净化病原提供参考。对249份病死鸡进行麦康凯与XLD培养基平行选择分离培养，根据菌落特征、革兰氏染色镜检以及设计沙门氏菌特异性引物扩增PCR检测和ATB自动细菌鉴定仪检测结果鉴定病原菌，最后进行血清学鉴定判定菌型。对分离株进行动物致病试验以及自动细菌鉴定仪对28种抗生素体外药敏试验检测。

关键词：沙门氏菌；分离鉴定；药敏试验；致病性

中图分类号：S858 文献标识码：A

沙门氏菌是肠杆菌科革兰氏阴性杆菌，广泛存在于环境或寄居于人和动物肠道内，绝大多数对人和动物具有致病性。感染沙门氏菌或食用被带菌者粪便污染的食品，可使人发生食物中毒。沙门氏菌病已成为一种常见多发的人畜共患病[1]。鸡是沙门氏菌最大的宿主，致病性鸡沙门氏菌是鸡场的重要病原菌，可引发鸡白痢、鸡伤寒和禽副伤寒，在鸡群中能垂直感染，被感染雏鸡大批死亡，成鸡生长性能或产蛋下降，死亡率高达80%，已成为危害养禽业的首要传染病之一[2]。目前对沙门氏菌的治疗为大量使用或滥用抗生素，从而忽视了对传染源和传播途径的综合防控，加之在抗生素的选择性压力下，造成沙门氏菌对抗菌类药物的耐药性和交叉耐药状况加剧，呈现多重耐药性，当多重耐药干扰抗菌药物的有效性时或传播给人类的其他病原时，会直接或间接的威胁人类的健康。因此，对沙门氏菌分离株耐药性的监测是意义重大的。

对广西部分养鸡场的鸡沙门氏菌病的流行情况进行调查，发现沙门氏菌广泛存在于鸡场中，常常造成鸡只的大规模发病和死亡，造成严重的经济损失，严重困扰着养鸡业的发展。在这种背景下，快速、准确地检出病原体和体外药敏分析结果就成为必要。目前，对耐药的分析主要采用K-O纸片法，耗时费力，存在药敏纸片种类较少的问题。本文从病死鸡分离培养沙门氏菌运用自动细菌鉴定及药敏仪对分离株进行药物的耐药性研究，分析鸡沙门氏菌对各类药物的耐药情况，为当前流行的鸡沙门氏菌的合理用药提供参考同时，防止沙门氏菌多重耐药菌株由食物链传播给人，危害人们的健康，避免多重耐药沙门氏菌给人们带来的各种疾病和造成治疗上的困难。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株及病料

质控菌株大肠埃希菌株ATCC25922购自中国微生物菌种保存中心；27株沙门氏菌分离株为本实验室于2013～2014年广西部分养鸡场分离并保存；249份病死鸡肝和脾和粪便标本来自2013～2014年广西部分禽类养殖场。

1.1.2 培养基

麦康凯琼脂（CM908）、木糖赖氨酸脱氧胆盐XLD琼脂（CM219）、营养琼脂（CM107）、肉浸液肉汤培养基（CM149）、三糖铁培养基（CM205）、赖氨酸铁琼脂（CM229）均购自北京陆桥技术有限公司；沙门氏菌属诊断学清购自宁波天润生物药业有限公司。

1.1.3 主要试剂

ATB Expression自动细菌鉴定仪ID 32 E（革兰氏阴性肠杆菌）鉴定反应试条（每试条上有32孔生物反应底物）及ATB VET（兽医专用药敏试条，每试条上有32孔生物反应底物）均购自法国Bio-Merieux公司生物梅里埃中国有限公司北京办事处。

1.1.4 主要仪器

鉴定仪系统Bio-Merieux ATB Expression比浊仪、恒温箱、梯度PCR仪。

1.1.5 试验动物

4周龄SPF级雌性昆明小鼠，购自广西中医药大学实验动物繁殖中心。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌分离纯化

直接镜检：取病料标本肝及脾组织块制备涂片，火焰固定、革兰氏染色镜检。细菌分离培养：将肝和脾标本无菌条件下接种于进行麦康凯和XLD培养基37。常规培养24h，对可疑菌落进行invA引物特异性扩增PCR检测。根据GenBank中已的沙门氏菌致病基因invA基因序列，通过DNAStar软件进行序列同源性分析，运用软件Oligo6和Primer Select设计出1对特异性引物（表1）-INVA，预期扩增invA基因片段为285bp。引物由天地杨生物科技（广州）有限公司合成。20ulPCR反应体系：2xTaq PCR MasterMix 10ul，上下引物（25pmol/ul）均0.25ul，模板DNA 1ul，双蒸水补至20ul，PCR反

应程序为：a. 94℃，5min；b. 94℃，30s；c. 56℃，30s；d. 72℃，35s；b～d 35个循环；e.最后72℃，10min；f. 16℃，∞。

表1 PCR特异性引物

引物名称 引物序列（5’3’） 靶基因 产物长度/bp 序列号

INVA F：GTGAAATTATCGCCACHTTCHHHCAA in

vA 285 AAT960

35

R：TCATCGCACCGTCAAAGGAACC

1.2.2 生化鉴定

经革兰氏染色为革兰氏阴性且氧化酶测定为阴性的菌，参照Bio-MerieuxATB自动细菌鉴定仪ID32E肠杆菌鉴定试验条操作说明，对分离、纯化的疑似菌落接于0.85%NaCl安培管，配制成0.5McFarland（比浊仪读数）菌悬液接种于ID 32 E肠杆菌鉴定试条55ul/孔，在鸟氨酸脱羧酶（ODC）、精氨酸双水解酶（ADH）赖氨酸脱羧酶（LDC）、脲酶（URE）、L-阿拉伯糖醇（LARL）、半乳糖酸盐（GAT）、5酮葡萄糖酸（5KG）滴2滴矿物油覆盖，盖上试条盖，好氧条件下37°培养24h后，在吲哚反应孔加1滴James试剂，运用ATB分析仪读取结果ATB相应软件分析结果。

1.2.3 血清型鉴定

取分离鉴定好的菌落接种普通营养琼脂，37℃培养18～24h，挑取菌落进行沙门氏菌A～F多价“O”诊断血清玻片凝集试验，并设生理盐水为阴性对照。玻片凝集试验用于筛选常见的菌体（O）抗原和鞭毛（H）抗原（包括第一相和第二相）鉴定，其方法为：在平板上，将琼脂培养的细菌与少量生理盐水混匀，与一滴沙门氏菌抗血清混合，摇晃并观察凝集情况，凝集为阳性，进行第一相和第二相鉴定。

1.2.4 动物致病试验

取分离鉴定好的菌落，用无菌生理盐水稀释成108～105菌/mL不同浓度菌悬液，取0.2mL腹腔接种小鼠，0.2mL生理盐水腹腔接种小鼠作对照，观察发病情况，病死小鼠心血肝脾接种麦康凯培养基培养。

1.2.5 药敏鉴定

参照BioMerieux ATB全自动鉴定及药敏仪ATB VET药敏试条操作说明操作。用0.85%NaCl制备0.5 McFarland的菌悬液，取10μL0.5McFarland的菌悬液于ATB培养基中，于ATB VET药敏条每孔接种135μL菌悬液，37℃培养18～24h，用ATB分析仪读取结果并用相应软件解释。

2 结果与分析

2.1 分离株的培养及形态特性

沙门氏菌属在麦康凯培养基中呈无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时为暗黑色；在XLD培养基呈粉红色带或不带黑色中心菌落，伤寒沙门氏菌为黄色菌落。

2.2 PCR检测结果

用PCR扩增出约285bp的DN段，与预期的目的片段大小一致。

M.DNA标准DL2000；1.阳性对照；2-10部分样品；11.阴性对照

图1 部分PCR检测结果

2.3 生化结果

对分离纯化的疑似菌落经ATB自动鉴定仪鉴定，筛选符合沙门氏菌属特征的为非常好的鉴定结果 （生化鉴定结果如表2），保存菌落。

表2 生化鉴定结果

生化项目名称 简称 生化结果 生化项目名称 简称 生化结果

β-葡萄糖酸酶β-Glucuronidase

α-半乳糖甙酶α-Galactosedase

L-鼠李糖Rhamnose

D-阿拉伯醇D-Arabitol

L-阿拉伯糖L-Arabinose

D-山梨醇D-sorbitol

丙二酸盐malonate

L天冬氨酸方胺酶L-Aspartate

D-甘露醇D-mannitol

L-阿拉伯醇L-Arab alcohol

5-酮基葡糖酸盐5-Ketogluconate

α葡萄糖甙酶α-Glucosaminidase

赖氨酸脱羧酶Lysindecarboxylase

肌醇Inosetol

β-半乳糖甙酶β-Galactosidase

蔗糖D-Sucrose βGUR

Αgal

RHA

DARL

LARA

SOR

MNT

AspA

MAN

LARL

5KG

αGLU

LDC

IND

β-GAL

SAC -

+

+

-

+

+

-

-

+

-

+

-

+

-

-

- 精氨酸双水解酶Argininedihydrolysase ADH -

d-海藻糖Trehalose TRE +

肌醇Inosetol INO -

古老糖Palatinose PLE -

d-纤维二糖D-Cellobiose

α-麦芽糖α-Maltose

鸟氨酸脱羧酶Ornithine decarboxylase

侧金盏花醇Adonitol

脲酶Urease

D-半乳糖酸盐同化D-Galacturonate

脂酶Lipase

β-葡萄糖甙酶β-Glucosaminidase

d-麦芽糖-Maltose

βN 乙酰葡萄糖胺N-Acetyl-β-glu

d-葡萄糖D-Glucose

酚红Phenol red CEL

αMAL

ODC

ADO

URE

GAT

LIP

βGLU

MAL

βNAG

GLU

RP -

-

+

-

_

-

+

-

+

-

+

+

2.4 血清鉴定结果

10株B群鼠伤寒沙门氏菌，7株D群鸡雏沙门氏菌，1株B群里定沙门氏菌，2株D群肠炎沙门氏菌，6株D群伤寒沙门氏菌，1株为沙门氏菌的某些亚型（无法定型）。从鉴定结果看出，鸡源沙门氏菌主要以B群鼠伤寒和D群鸡雏及伤寒沙门氏菌为主。

2.5 感染试验结果

高浓度剂量接种小鼠18h内死亡，低浓度接种小鼠致拉稀，对照小鼠不发病。发病鼠心血接种麦康凯和XLD培养基培养，取肝脾组织研磨提取细菌总DNA，运用PCR扩增出285bp亮带，证明为沙门氏菌感染致病。

2.6 27株分离株药敏结果与分析

经ATB Antibiogram药敏条鉴定，分离株对28种抗生素的耐药情况见表3。

表3 27株沙门氏菌分离株的耐药情况

抗菌药物 MIC/（mg/l） 耐药菌株数 耐药率 抗菌药物 MIC/（mg/l） 耐药菌株数 耐药率

青霉素（PG）Penicilline 0.25 27 100% 红霉素（ERY）Erythromycine 1 27 100%

阿莫西林（AMO）Amoxicilline 4 10 37.4% 林可霉素（LIN）Lincomycine 2 27 100%

复方阿莫西林（AMC）Amoxicil.ac 4 9 33.3% 原始霉素（PRI）Pristinamycin 2 27 100%

苯唑西林（OXA）Oxacilline 2 27 100% 泰洛星（TYL）Tylosin 2 27 100%

头孢噻吩（CFT）Cefalotine

头孢哌酮（CFP）Cefoperazone

链霉素（STR）Streptomycine

大观霉素（SPE）Spectinomycine

卡那霉素（Kan）Kanamycine

庆大霉素（Gen）Gentamicine

安普霉素（APR）Apramycine

氯霉素（CMP）Chloramphenicol

四环素（Tet）Tetracycline

多西环素（）Doxycyclin 8

4

8

64

8

4

16

8

4

4 9

6

24

1

1

12

12 33.3%

22.2%

82.8%

0%

3.7%

0%

0%

3.7%

44.4%

44.4% 多粘菌素E（COL） Colistine

复方新诺明（TSU）Cotrimoxazole

磺胺甲恶唑（SMZ）Sulfamethizole

氟甲喹（FLU）Flumequine

恶喹酸（OXO）ac.Oxolinique

依氟沙星（ENR）Enrofloxacine

呋喃妥因（FUR）Nitrofurantoine

夫地西酸（FUC）ac.Fusidique

利福平（RFA）Rifampicine

甲硝唑（MTR）Metronidazole 4

2

100

4

2

0.5

25

2

4

4 4

3

23

16

18

10

20

27

27

27 14.8%

11.1%

85.2%

59.3%

66.7%

37.4%

74.0%

100%

100%

100%

根据本试验结果，27株沙门氏菌分离株对青霉素、大环内酯类的红霉素、林可霉素、原始霉素、泰洛星以及夫地西酸、利福平、甲硝唑耐药率高达100%；而链霉素、磺胺甲恶唑耐药率也高达80%以上；分离株多呈现多重耐药，27株共同有九重耐药（PG+OXA+ERY+LIN+PRI+TYL+FUC+RFA+MTR）；而对氨基糖苷类的大观霉素、庆大霉素和安普霉素最敏感，敏感性为0%，可以作为临床基层治疗沙门氏菌的主要用药方向。

3 讨论

沙门氏菌是世界范围内最为重要的共患食源性病原菌，是危害食品安全的重要风险隐患因子，30%的食源性细菌污染由其引发[3]，其污染状况直接关系着公共卫生安全。畜禽产品是沙门氏菌传播的重要媒介，畜禽生长养殖场对沙门氏菌的监控和净化成为一大关键，而近年来对沙门氏菌的防治多盲目使用或滥用大量抗生素，饲料添加抗菌素等手段，从而忽视了对传染源和传播途径的综合防控，加之在抗生素的选择性压力下，造成沙门氏菌呈现多重耐药性，当多重耐药干扰抗菌药物的有效性时或传播给人类的其他病原时，会直接或间接的威胁人类的健康[4]，因此开展沙门氏菌的耐药性监测意义重大，为当前的沙门氏菌的流行株以及耐药情况提供参考依据，为养殖场合理用药提供帮助。

传统的细菌分离生化鉴定繁琐耗时，K-B药敏试验存在药敏试验种类的不全、人为读取的误差等。本文运用分子试验PCR扩增特异性鉴定方法结合BioMerieux ATB自动细菌鉴定及药敏仪，自动化生化仪有32种生化项目，可鉴定700多种细菌，24h就能读取结果，省事省力，为争取病情的检测节省了时间。药敏试剂条原理是根据不同浓度的抗菌药物孔的浊度来鉴定对该抗菌药物敏感，耐药或中介敏感可根据细菌属选择肠杆科28种药敏试验，针对肠杆科常用抗生素进行鉴定，能及时的指导用药。全自动分析法较传统的方法信息化自动化程度高，操作方便快捷，避免了很多主观因素的影响[5]，克服了常规的生化鉴定和药敏试验种类的不全、繁琐操作的失误和读取结果人为的误差，因此本试验的鉴定和药敏结果是准确而可靠的[6] 。

从药敏试验的结果看，鸡源沙门氏菌的耐药性已十分严重，由于沙门氏菌的耐药性可通过耐药性质粒在细菌间传播和扩散。由于临床上各种抗生素的大量应用和饲料中药物长期的添加，使得曾经是治疗沙门氏菌病的非常有效的药物如链霉素配合氨苄、氟喹诺酮类等药物对沙门氏菌无效，而对临床上新的应用较少的药物如部分氨基糖苷类敏感，所以即使是最有效的药物如果大量和长期应用，也会产生耐药性，失去治疗作用。及时掌握沙门氏菌的耐药动态，对基层临床指导用药意义重大。

参考文献

[1] Ammari S， Laglaoui A， En-nanei L，et al. Isolation， drug resistance and molecular characterization of Salmonella isolates in northern Morocco[J].Journal of Infection in Developing Countries，2009，3（9）：695-703.

[2] 武志强，粤北地区鸡沙门氏菌分离株的生化反应特性[J].中国预防兽医学报.2009，31（5）：406-408

[3] 张莉，曾艳兵，尹德风，等.畜禽沙门氏菌药敏性研究及两种测定方法比较，2013，25（5）：114-116.

[4] 王晓泉，焦新安，陈祥，等.江苏部分地区食源性和人源沙门氏菌的多重耐药性研究[J].微生物学报，2007，47（2）：221-227.

[5]谭瑶，赵清.K-B纸片扩散法药敏试验[J].检验医学与临床，2010，7（20）：

2290-2291.

[6] Grollier G， Burucoa C， BonninM， et al.Identification and susceptibility testing for obligate anaerobic bacteria using a semi-automated API ATB plus system[J]. Ann Biol Clin，1992，50（6）：393-397.

作者简介：张步娴（1968-），女，汉族，广西贵港市人，广西区动物疫病预防控制中心，研究方向：禽病。