表没食子儿茶素没食子酸酯对人宫颈癌细胞系HeLa细胞凋亡及bcl―2/bax表达的影响

[摘要] 目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对宫颈癌细胞系HeLa细胞凋亡及bcl-2/bax表达的影响。 方法 体外培养HeLa细胞，分为对照组和实验组，实验组用不同浓度的EGCG处理24、48、72 h，对照组加入等体积的培养基。采用MTT法测定EGCG对HeLa细胞增殖的影响；倒置显微镜下观察细胞的形态学变化；EGCG（浓度分别为20、40、80 μg/mL）处理HeLa细胞48 h后，分别采用流式细胞仪检测细胞凋亡和周期、分光光度计检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Casepase-3）相对活性、Western blot法检测bcl-2/bax蛋白表达情况。 结果 EGCG（浓度10～100 μg/mL）能抑制HeLa细胞的增殖，呈剂量和时间依赖性；倒置显微镜下可观察到典型的细胞凋亡形态；浓度为20、40、80 μg/mL的EGCG作用HeLa细胞48 h后，细胞凋亡率逐渐上升，分别为12.4%、23.4%、35.4%，明显高于对照组（3.3%）；细胞周期结果显示EGCG能抑制细胞的G1期行进和G1/S转换，降低S期细胞比例；实验组HeLa细胞Caspase-3相对活性分别为（1.36±0.07）、（1.85±0.06）、（2.45±0.07），均高于对照组（0.93±0.06），差异均有统计学意义（P < 0.05）；bax蛋白表达量升高，而bcl-2蛋白表达量降低，呈剂量依赖性。 结论 EGCG能抑制HeLa细胞的增殖并诱导其凋亡，其作用机制可能与增加细胞Casepase-3活性、下调bcl-2基因的表达及上调bax基因有关。EGCG是一种前景广阔的抗肿瘤药物。

[关键词] 表没食子儿茶素没食子酸酯；HeLa；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶

[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）08（c）-0029-05

Effects of EGCG on cell apoptosis in cervical cancer HeLa cells and expression of bcl-2/bax

QIN Jing HONG Li

The Second Department of Gynecology， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Objective To explore the effect of EGCG on cell apoptosis in cervical cancer line HeLa cells and expression of bcl-2/bax. Methods HeLa cells were cultured in vitro， and they were divided into two groups， including control group and experimental group. The control group was received only the culture medium， and the experimental group was treated by EGCG at different concentrations for 24、48、72 h respectively. The cell survival of the two groups were determined by the MTT method； the changes of cell morphology were observed by inverted microscope； apoptosis and cell cycle were analyzed by flow cytometry； the relative activity of caspase-3 was monitored by spectrophotometer； the changes of protein expression of bcl-2 and bax were detected by Western blot. Results From the data of MTT， the cell proliferation of human cervical cancer HeLa cells was inhibited by EGCG （10-100 μg/mL） in a dose-dependent and time-dependent manner. Typical apoptosis morphology of HeLa cells was observed by inverted microscope. Flow cytometry assays showed that EGCG significantly induced apoptosis in HeLa cells. 48 h after treated with EGCG （20， 40， 80 μg/mL）， the apoptosis rate of the experimental group were increased gradually， they were 12.4%， 23.4%， 35.4% respectively， higher than that of the control group （3.3%） obviously. Flow cytometry assays demonstrated that EGCG blocked the cell cycle at the G1 to S transition and decreased the percentage of S-phase cells. The relative activity of Caspase-3 of experimental group were （1.36±0.07）， （1.85±0.06） and （2.45±0.07） respectively， higher than that of the control group （0.93±0.06）， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The data of Western blot showed that EGCG down-regulated bcl-2 and up-regulated bax in a dose-dependent manner. Conclusion EGCG can inhibit the proliferation of HeLa cells and promote apoptosis， and the anticancer effect of EGCG may be associated with the down regulation of bcl-2 expression and up regulation of bax expression， as well as the increase of relative activity of Caspase-3. EGCG may be a promising antitumor agent for cancer treatment.

[Key words] EGCG； HeLa cell； Caspase-3

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，其在全球恶性肿瘤中发病率高居第2位，病死率居第4位，而在发展中国家其发病率和病死率均高居第2位，全球每年有超过25万患者死于宫颈癌[1]。近年来，宫颈癌发病率趋于年轻化，严重危害着妇女的健康。宫颈癌患者死亡的主要原因是肿瘤复发和转移。化疗药物在一定程度上能抑制肿瘤细胞增殖和转移，但传统的化疗药物毒性大且由于肿瘤耐药性，临床上患者疗效并不理想，且部分患者难以耐受。因此从天然植物中寻找高效低毒的具有抗肿瘤活性的成分成为了国内外研究热点。绿茶是公认的健康饮料，近年来发现其富含有抗肿瘤成分，包括表儿茶素（epicatechin，EC）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）和表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）。在这些茶多酚中，EGCG是含量最高且药理活性最强的单体，其具有广泛的药理活性，包括抗肿瘤、降血压、降脂、降血糖及抗氧化等。研究证实，EGCG对肝癌、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤均有拮抗作用[2-5]。本研究旨在探讨EGCG对宫颈癌HeLa细胞凋亡及bcl-2/bax表达的影响，以期为临床应用提供理论研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人宫颈癌细胞系HeLa细胞购自中国科学院上海细胞库；EGCG购于Sigma公司（E4143，纯度≥95%）；胎牛血清购自Invitrogen公司；RPMI1640培养液购于杭州四季青生物材料研究所；噻唑蓝（MTT）试剂盒购于武汉谷歌生物科技有限公司；AnnexinV/PI细胞凋亡检测试剂盒购于Bender公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-3）活性检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司。Bcl-2、bax抗体购于美国Cell Signaling Technology公司；辣根酶标记兔抗山羊IgG购自武汉博士德生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将HeLa细胞培养于含10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的PMI1640培养液中，置于37℃，5%CO2，湿度饱和，培养箱内培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖抑制率 取对数生长期的HeLa细胞，调整细胞浓度，以1×104/mL的浓度接种于96孔板，每孔200 μL，待细胞贴壁后分别加入EGCG终浓度为0、10、20、40、60、80、100 μg/mL的培养液，并设立调零孔。每个浓度设5个复孔，继续培养24、48、72 h，于实验结束前4 h加入MTT试剂20 μL/孔，继续孵育4 h，吸掉上清，加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL/孔，摇床上振荡10 min，结晶充分溶解后酶标仪上检测570 nm处的吸光值（A值），细胞增值抑制率=[1-（实验组平均A值-调零孔A值）/（对照组平均A值-调零孔A值）]×100%。

1.2.3 显微镜下观察细胞形态 取对数生长期细胞，调整浓度接种于12孔板中，贴壁后加入EGCG终浓度为0、10、20、40、60、80、100 μg/mL的培养液连续培养24、48、72 h后置于倒置显微镜下观察细胞生长、形态等情况。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 将对数生长期细胞以1×106/mL浓度接种于6孔培养板内，贴壁后分别加入EGCG终浓度分别为0、20、40、80 μg/mL的培养液，培养48 h后，收集细胞，离心固定后加入AnnexinV-FITC和PI，室温避光染色。筛网过滤后送流式细胞仪检测。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞周期 细胞接种及分组同上，培养48 h后，收集细胞，70%乙醇4℃固定过夜，37℃水浴30 min，加入PI，4℃避光孵育15 min。筛网过滤后流式细胞仪检测。

1.2.6 分光光度法检测Caspase-3活性变化 细胞接种及分组同上，培养48 h后，收集细胞，分别加入预冷裂解缓冲液，冰浴裂解15 min，1200 r/min离心15 min，取上清按试剂盒说明书操作，酶标仪上405 nm测定Caspase-3的酶活性，OD405为样品中Caspase-3催化产生pNA（p-nitroaniline）产生的吸光度，可反映Caspase-3活性强弱。

1.2.7 Western blot检测bcl-2、bax蛋白表达变化 细胞接种及分组同上，处理48 h后收集细胞，参照细胞浆蛋白抽提试剂盒说明书进行操作，提取细胞总蛋白，并测定蛋白浓度，蛋白样品加入1/5体积的5×上样缓冲液，沸水煮沸5 min，根据蛋白浓度以每孔20 μg/孔上样，行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后电转至PVDF膜上，用室温封闭1 h，分别加入1∶1000稀释的兔抗人bcl-2、bax蛋白，4℃过夜。β-actin作为内参，TBST洗膜3次，加入1∶1000稀释的辣根酶标记的兔抗山羊IgG，室温孵育2 h，同样洗膜3次，ECL发光液显色，观察各条带深浅变化。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGCG对HeLa细胞增殖的影响

如图1所示，EGCG在10～100 μg/mL范围内均可抑制HeLa细胞增殖，且随着EGCG浓度的升高和处理时间的延长，增殖抑制作用也逐渐增强，呈浓度和时间依赖效应。

图1 不同浓度表没食子儿茶素没食子酸酯对HeLa细胞抑制率的影响

2.2 细胞形态观察

显微镜下对照组细胞生长旺盛，折光率较高，胞体较大，成梭形或多边形，胞质均匀透明，几乎无漂浮细胞，且随培养时间的延长形态变化不明显。EGCG处理组的细胞增殖明显受到抑制，且随着药物浓度的增加和处理时间的延长，细胞逐渐变小、变圆、折光率减弱、核浓缩等，部分脱落漂浮于培养瓶中。

2.3 EGCG对HeLa细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测结果显示，EGCG能诱导HeLa细胞凋亡。如图2所示，EGCG（浓度分别为20、40、80 μg/mL）处理HeLa细胞48 h后，细胞凋亡率分别为12.4%、23.4%、35.4%，明显高于对照组凋亡率（3.3%）。

A：0 μg/mL；B：20 μg/mL；C：40 μg/mL；D：80 μg/mL

图2 流式细胞仪检测表没食子儿茶素没食子酸酯对HeLa细胞

凋亡率的影响

2.4 EGCG对HeLa细胞周期的影响

流式细胞仪检测细胞周期数据显示，EGCG浓度分别为0、20、40、80 μg/mL处理HeLa细胞48 h后，能抑制HeLa细胞的G1期行进和G1/S转换，S期细胞比例降低，表示EGCG能够阻滞细胞周期。见图3。

A：0 μg/mL；B：20 μg/mL；C：40 μg/mL；D：80 μg/mL

图3 流式细胞仪检测表没食子儿茶素没食子酸酯

对HeLa细胞周期的影响

2.5 EGCG对HeLa细胞Caspase-3活性的影响

对照组HeLa细胞Caspase-3相对活性为（0.93±0.06），实验组（EGCG浓度分别为20、40、80 μg/mL）处理HeLa细胞48 h后，HeLa细胞Caspase-3相对活性分别为（1.36±0.07）、（1.85±0.06）、（2.45±0.07）。与对照组比较，EGCG组Caspase-3相对活性升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图4。

与0 μg/mL比较，#P < 0.05

图4 表没食子儿茶素没食子酸酯对HeLa细胞半胱氨酸天冬氨酸

蛋白酶相对活性的影响

2.6 EGCG对HeLa细胞bcl-2、bax蛋白表达的影响

EGCG处理HeLa细胞48 h后，结果显示随着EGCG浓度的升高，bax蛋白表达量也逐渐升高，而bcl-2蛋白表达量逐渐降低，灰度值分析显示，实验组与对照组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图5。

A

B

A：Western bloting图；B：bcl-2和bax灰度值分析；与0 μg/mL比较，#P < 0.05

图5 表没食子儿茶素没食子酸酯对HeLa细胞bcl-2、bax表达的影响

3 讨论

细胞凋亡是多细胞机体维持内环境稳定的重要自我调节机制[6]，细胞凋亡与细胞增殖之间的平衡在肿瘤发生发展中具有重要意义[7]，细胞凋亡是程序化、多基因调控的细胞死亡过程，通过诱导细胞凋亡可能是肿瘤治疗最有效的途径之一，因此促进细胞凋亡已经成为抗肿瘤研究的热点。国内外细胞实验和动物实验证实，EGCG在体内外对多种肿瘤细胞的增殖具有抑制作用，并可促进细胞凋亡[8-13]。本研究也发现，EGCG在10～100 μg/mL浓度范围均能抑制人宫颈癌HeLa细胞的增殖，且呈现明显的剂量依赖及时间依赖效应。在倒置显微镜下可见到凋亡细胞的形态；流式细胞仪检测结果显示，EGCG处理HeLa细胞48 h后可诱导凋亡，且随着药物浓度的升高细胞凋亡率亦增加，呈浓度依赖效应。细胞凋亡研究认为，Caspase家族的激活在细胞凋亡过程中起了关键性作用，被认为是诱发凋亡的直接效应物。已发现的Caspase家族有10余种，其中Caspase-3是该家族的重要成员，是细胞凋亡过程中的关键酶。本研究发现，EGCG呈浓度依赖性的增加HeLa细胞Caspase-3相对活性，提示EGCG能抑制细胞增殖，并可能是通过增强细胞Caspase-3活性从而促进细胞凋亡。

为进一步探讨EGCG诱导细胞凋亡，本研究检测bcl-2、bax蛋白表达的变化，研究发现不同EGCG处理后，HeLa细胞bcl-2表达下调，bax表达上调。bcl-2是一种内膜蛋白，主要存在于线粒体、内质网和核膜上，bcl-2在多种肿瘤细胞中表达，能通过增强线粒体膜电位，抑制钙离子释放，阻止核酸内切酶活化，进而发挥抗凋亡作用；bax属于bcl-2家族成员，其与bcl-2作用相反，可直接激活死亡效应因子Caspase或改变细胞膜通透性引起细胞色素C释放某些离子和小分子通过细胞膜，进而促进细胞凋亡。细胞bcl-2和bax比例改变可调节细胞凋亡[14]，当bcl-2占优势时，细胞具有抗凋亡作用；当bax过表达时，细胞容易在诱导剂作用下发生凋亡[15]。

综上所述，EGCG可抑制HeLa细胞增殖并诱导细胞凋亡，其诱导细胞凋亡机制可能是通过上调bax蛋白表达并下调bcl-2蛋白表达，增加细胞Caspase-3活性。

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（收稿日期：2014-03-20 本文编辑：任 念）