MLPA快速产前诊断染色体病需综合分析以缓解孕妇焦虑情绪

【摘要】 目的：分析MLPA技术在产前快速检测常见染色体非整倍体疾病中的诊断价值和对于染色体部分片段拷贝数变异的诊断价值。材料和方法：采用319例羊水标本分别进行MLPA-P095试剂盒检测21、13、18、X和Y染色体的数目并与细胞培养核型分析金标准进行对比。选取其中7例存在染色体部分片段拷贝数变异的标本，提取其父母的外周血DNA行MLPA分析，将羊水标本与父母的MLPA检测结果进行对比。结果：4例染色体非整倍体疾病患儿采用MLPA均能明确检出，2例母血污染的标本被误诊为47，XXY综合征。7例存在染色体部分片段缺失/重复的羊水与父母比对后至少与其中一人一致，而父母均不存在临床症状，经解释后患者焦虑情绪有效缓解。结论：MLPA技术可以用于产前快速诊断常见染色体非整倍体综合征，但部分片段未根据中国人群多态性进行优化，不能据此判断是否存在染色体部分片段缺失/重复综合征。

【关键词】 MLPA;产前诊断;非整倍体综合征

Rapid prenatal diagnosis of chromosomal aneuploidy to calm the pregnant women

Zhang Jun1,Lu Bingwen1,Lin Junwei1,Teng Benqi1*

Address:Department of Obstetrics, The third affiliated hospital of the Sun Yat-sen University, Guangdong Guangzhou, 510630

Correspondent Author:Teng Benqi,Department of Obstetrics,The third affiliated hospital of the Sun Yat-sen University,Guangdong Guangzhou,510630,Tel:020-85252625,E-mail:Funds:Guangdong Medical Science Funds B2009076

【Abstract】 Objective: To analyze the diagnostic value of MLPA technique in prenatal detecting of chromosomal aneuploidy and partial deletion and duplications. Methods: 319 amniotic fluid samples were analyzed with MLPA 095 kit for 21, 13, 18, X and Y chromosomes. 7 AF cases of partial dup/del were compared with their parents. Results: 4 cases of aneuploidy were correctly detected with MLPA. 2 cases of maternal blood contaminating samples were misdiagnosed with 47, XXY. Seven cases of partial del/dup were the same with at least one of their parents. Conclusion: MLPA is fitted for rapid prenatal diagnosis of aneuploidy, while partial dul/del syndromes can not be diagnosed with only this method.

【Key Word】 MLPA; Prenatal Diagnosis; Aneuploidy

【中图分类号】 R714 【文献标识码】 B 【文章编号】 1007-8231（2011） 07-0391-02

染色体非整倍体是指染色体数目异常,包括染色体整条或者部分片段的缺失或者重复。传统的羊水培养核型分析的染色体产前诊断技术存在检测时间过长(一般需2-3周),工作强度大,技术要求高等不足之处，无法为高危孕妇提供快速的检测结果，不易于缓解孕妇紧张焦虑的不良情绪，有可能导致流产等不良妊娠结局[1,2]。近年来发展起来的产前诊断分子技术包括荧光原位杂交(FISH)、短串联重复序列（STR）分析、荧光定量PCR以及多重连接依赖式探针扩增技术(MLPA)等，能够快速给予孕妇准确可靠的结果，有效地弥补了核型分析技术的不足。其中MLPA技术因其高通量、高分辨率、低成本等优点在快速产前诊断中显示出了较为突出的应用潜力。同时该技术由于采用长度约40-50个碱基的DN段作为探针，因此能够区分出染色体微小片段的拷贝数变异现象。由于缺乏相应的确诊依据，给临床医生解释胎儿预后带来困难，也给孕妇及家人带来更多不必要的心理负担[2]。本研究对MLPA技术在羊水产前快速针对染色体非整倍体疾病及染色体小片段缺失（或重复）的检测能力进行了分析。

1对象与方法

1.1研究对象:标本来自于2009年5月至2010年12月期间来我院行羊膜腔穿刺术产前诊断的孕妇共319例，孕周为17～24周时。在超声引导下抽取羊水，其中5ml用于MLPA检测,20ml用于染色体培养。其中7例羊水MLPA结果存在单个峰值异常，经知情同意后抽取孕妇本人及丈夫的外周血标本2ml用于MLPA分析。

1.2.1标本处理:取羊水标本置于1.5ml的离心管中13000rpm离心10min,去上清至剩余50～100μl,然后采用Qiamp DNA mini kit(Qiagen，德国)按照说明书的要求提取DNA并置于-20℃冰箱中储存，外周血DNA提取亦采用上述试剂盒进行。

1.2.2MLPA反应:选取P095-A2Aneuploidy试剂盒（MRC，荷兰）按照说明书要求进行操作，大致方法如下：选取DNA50ng,98℃变性5min后加入1.5μl的SALSA探针混合液和1.5μl的MLPA缓冲液,混匀后95℃孵育1min,然后60℃过夜(16～18h)。将杂交产物在54℃下加入现配的连接酶混合液32μl,混匀后,54℃孵育15min,接着98℃加热5min灭火连接酶；取连接产物10μl加入4μl的SALSAPCR缓冲液、10μl的多聚酶混合液、26μl去离子水后混匀,进行PCR反应（ABI9700，美国），PCR反应条件为:95℃30s;60℃30s;72℃1min,35个循环,72℃再孵育20min。取1μlPCR产物与9μl的甲酰胺（ABI，美国）、0.1μl的GS500(LIZ)混合后95℃热变性5min,立即放入冰盒中至少2min,然后采用3100DNA测序仪（ABI美国）进行毛细管电泳仪并分析。

1.2.3MLPA数据分析:采用Genemarker1.85软件（Softgenetics，美国）进行数据分析,以正常人作为对照,扩增后探针信号强度与正常人信号相比比率大于1.3判定为重复,小于0.7判定为缺失。同一染色体所有位点同时出现数目异常认定为染色体非整倍体。

1.3羊水染色体培养按常规步骤进行。

2结果

2.1羊水MLPA-P095检测结果与羊水细胞培养核型分析结果比较如表1所示。4例羊水培养核型分析异常的病例包括3例21三体综合征和1例47，XXX综合征，采用MLPA方法均得到了准确的诊断。2例混有较明显母血污染的标本MLPA检测结果为47，XXY，但核型分析结果为46，XY。若排除母血污染的标本，MLPA和细胞培养核型分析的符合率达到100%。

表1MLPA与核型分析结果比较

2.2MLPA-P095检测结果为单独峰值异常的标本中选择7例进行了父母双方的外周血MLPA-P095检测，并将结果与羊水MLPA结果比较。结果如表2所示：13、18、21、X染色体上均出现单独发生片段拷贝数变异的位点。同时与父母做对比的结果显示在父母双方中至少有一方与胎儿的MLPA检测结果相一致。由于父母双方均未表现出临床症状，因此估计上述位点异常不导致微缺失或微重复综合征。经解释说明后孕妇表示理解，紧张和焦虑得到有效缓解。

3讨论

MLPA技术因其快速、低成本、高通量等优点在检测基因组拷贝数变化中显示出了良好的应用价值。其原理是针对染色体上的特定序列设计若干对探针, 每对探针的末端为共有的一段序列。当两条探针与目标基因完全配对杂交后, 再通过连接酶将其连接, 从而形成一条可供扩增的完整杂交探针，然后通过一对和共有序列一致的通用引物进行 PCR扩增,并通过毛细管电泳进行分离和定量。这样就可以将片段之间拷贝数的不同转化为毛细管电泳峰面积的不同和进行半定量分析[3]。我们用 MLPA技术检测对300余例羊水标本进行检测,结果显示假如剔除羊水混血等标本，MLPA技术与常规染色体培养核型分析对于普通的非整倍体诊断符合率达到100%。而MLPA相比传统的培养方法所需时间从2-3周显著缩短到2至3天，可以有效缓解唐筛高危孕妇的紧张焦虑情绪。

MLPA作为快速检测染色体非整倍体情况的技术手段具有快速、便捷、准确等特点，因此在国外得到较为广泛的应用。但是由于检测探针仅为40-50个碱基的长度，如果该片段发生缺失、重复或者突变，均有可能导致杂交结果的异常，最终影响对结果的分析[4]。因此在P095试剂盒中每条染色体分别提供了多个探针以便综合分析。本研究发现多个P095检测出现单独某个峰值出现偏高或偏低的羊水标本，但是仅凭此判断存在染色体的部分缺失或重复存在风险。经过对羊水标本和亲代外周血标本进行MLPA结果比较，在7例病例中都能够发现相同的位点的峰值变化。考虑其染色体即使存在部分重复或部分缺失亦可能为人群特有的多态性现象，并不会致病。本研究中发现的可能存在结果误读的探针片段涉及13、18、21、X染色体的多个片段，分析其原因可能是国外试剂盒在研发中采用的人群多态性数据库或者筛查的样本多集中在白种人，并没有对足够的黄色人种进行测试[5]。同时本研究也发现在已发现的检测结果为染色体部分数目异常的样本通常仅存在单独位点的数量异常，如果综合所有位点进行分析，并不会影响判断，但是对于染色体部分缺失或重复则有可能存在误读，需要进一步采取其他方法进行验证。

总之，MLPA技术可以用于染色体非整倍体异常的快速产前诊断，但是由于人群多态性的关系，还需要对部分探针针对中国人群进行进一步优化和调整，否则可能在染色体部分缺失或重复的情况下出现误判。如出现单位点异常，有必要对胎儿亲代行MLPA分析。

参考文献

[1] Comparison of multiplex ligation-dependent probe amplification and karyotyping in prenatal diagnosis. Boormans EM, Birnie E, Oepkes D,et al.Obstet Gynecol.2010 Feb;115(2 Pt 1):297-303.

[2] Economic evaluation of multiplex ligation-dependent probe amplification and karyotyping in prenatal diagnosis:a cost-minimization analysis. Boormans EM,Birnie E,Hoffer MJ,et al Arch Gynecol Obstet.2011 May 19.

[3] Detection of chromosome aneuploidies in chorionic villus samples by multiplex ligation-dependent probe amplification.Kooper AJ,Faas BH,Feuth T,et al.J Mol Diagn.2009 Jan;11(1):17-24

[4] Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) in prenatal diagnosis-experience of a large series of rapid testing for aneuploidy of chromosomes 13,18,21,X,and Y.Gerdes T,Kirchhoff M, Lind AM,et al.Prenat Diagn.2008 Dec;28(12):1119-25.

[5] Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) as a stand-alone test for rapid aneuploidy detection in amniotic fluid cells.Kooper AJ,Faas BH,Kater-Baats E,et al.Prenat Diagn.2008 Nov;28(11):1004-10.

通讯作者

滕奔琦，中山大学附属第三医院产科。

基金项目

广东省医学科学基金B2009076。