2O2损伤C2C12细胞的保护作用'> 化学性低氧对H2O2损伤C2C12细胞的保护作用

摘　要：目的：通过化学模拟（COCl2）低氧处理小鼠骨骼肌卫星细胞（C2C12），探讨合理的体外化学模拟低氧模式及其保护机制，为骨骼肌损伤的修复提供理论依据。方法：体外培养C2C12细胞，利用COCl2模拟低氧状态，MTT法检测C2C12细胞活性，DCF法测定各组细胞内活性氧（ROS）含量，Western　blot法检测细胞核内Nrf2蛋白含量。结果：1）COCl2处理后，各实验组吸光度呈剂量依赖性下降，与对照组相比，COCl2浓度≥25　μmol/L，差异具有显著意义（P＜0.05）。2）COCl2处理后加入H2O2，各实验组吸光度与H2O2组比较，5、10　μmol/L　COCl2预处理组细胞活性明显改善（P＜0.05）。3）与对照组相比，H2O2组相对荧光强度显著上升；与H2O2组比较，COCl2预处理组相对荧光强度则有明显下降（P＜0.05）。4）对照组C2C12细胞核内Nrf2蛋白含量极少，H2O2组核内Nrf2含量有所增加，预处理组核内Nrf2蛋白含量增加则更加显著。结论：体外培养C2C12细胞进行化学模拟低氧时，要考虑COCl2的作用浓度，低浓度COCl2预处理可能通过激活Nrf2减轻H2O2诱导的C2C12细胞氧化应激损伤。

关键词：　C2C12；　低氧；　ROS；　细胞培养；　COCl2

中图分类号：G804.7

文献标识码：A

文章编号：1007-3612（2012）09-0065-06

The　Protective　Effect　of　Chemical　Hypoxia　on　Oxidative　Damage　Induced　by　H2O2　in　C2C12　Cell

LIU　Yong，　LI　Jun-ping，　LUO　Dong-mei

（Beijing　Sport　University，　Beijing　100084，　China）

Abstract：Objective：　In　this　study，　mouse　skeletal　muscle　satellite　cell　（C2C12）　was　used　as　the　cell　model　for　COCl2　to　explore　reasonable　mode　for　COCl2-simulated　hypoxia　in　vitro，　and　the　mechanism　of　protective　effect　by　the　pretreatment　on　H2O2-induced　oxidative　damage　of　COCl2　in　C2C12　cell，　for　providing　references　for　the　reparation　of　skeletal　muscle.　Methods：　C2C12　cell　was　cultivated　in　vitro.　The　hypoxia　condition　was　simulated　by　COCl2.　Cell　activity　of　C2C12　cell　was　determined　by　MTT　method.　The　content　of　reactive　oxygen　species　（ROS）　in　C2C12　cell　was　examined　by　DCF　method　and　the　protein　content　of　Nrf2　in　the　nucleus　of　C2C12　cell　by　Western　blot.　Results：　1）　After　COCl2　treatment，　comparing　with　the　control　group，　the　absorbance　in　all　experiment　groups　decreased　in　dose　dependent　when　COCl2≥25　μmol/L，　and　the　difference　was　significance　（　P　＜0.05）.　2）　After　COCl2　treatment，　the　researcher　added　H2O2　into　C2C12　cell.　Comparing　with　H2O2　group，　the　cell　activity　improved　significantly　in　5　and　10　μmol/L　COCl2　groups　（　P　＜0.05）.　3）　Comparing　with　the　control　group，　the　relative　fluorescence　intensity　upgraded　significantly　in　H2O2　group.　But　comparing　with　the　H2O2　group，　the　relative　fluorescence　intensity　decreased　significantly　in　5　and　10　μmol/L　COCl2　groups　（　P　＜0.05）.　4）　The　level　of　Nrf2　protein　in　the　nucleus　of　C2C12　was　very　low　in　the　control　group.　The　content　of　Nrf2　in　the　nucleus　increased　in　H2O2　group，　and　it　further　increased　significantly　in　5　and　10　μmol/L　COCl2　groups.　Conclusion：　Simulating　hypoxia　used　COCl2　in　C2C12　cell　in　vitro　need　to　consider　the　concentration　of　COCl2.　Pretreatment　of　COCl2　at　low　level　may　decrease　H2O2-induced　C2C12　cell　oxidative　damage　through　activating　Nrf2.

Key　words：　C2C12；　hypoxia；　ROS；　cell　culture；　COCl2

骨骼肌损伤是运动医学领域非常多见的运动创伤，损伤后骨骼肌的修复和再生的发生、发展和转归研究在骨骼肌损伤后的治疗和康复领域具有重要的临床和现实意义。1961年，Mauro利用电子显微镜在青蛙的肌肉中发现了卫星细胞［1］，并在许多脊柱动物中也见到它，卫星细胞作为肌细胞的来源得到逐步确认。骨骼肌损伤后，需要激活骨骼肌卫星细胞来提供足够的细胞核，通过增殖、分化，最终融合形成新的骨骼肌细胞，从而修复已经损伤的骨骼肌［2］。低氧预处理（hypoxia　pretreatment）是指适度的缺氧可触发机体的内源性保护机制，使机体对其后继发生的严重缺氧或其它致死性应激产生防御和抵抗作用。低氧预处理具有明确而广泛的内源性保护作用，可对缺血、缺氧、缺血-缺氧、缺血-再灌注等损伤产生耐受，对氧化应激、紫外线、化学药物等引起的伤害也产生抵抗作用［3-4］。氯化钴（COCl2）是常用的缺氧模拟化合物，COCl2预处理可产生与缺氧预处理相似的细胞保护作用［5-6］。

Nrf2是细胞调节抗氧化应激反应的重要核转录因子，在多种组织和细胞，包括骨骼肌细胞中广泛表达。生理情况下，Nrf2与其抑制因子Keap1相结合，活性处于相对抑制状态。在细胞处于氧化应激时，Nrf2与Keap1解偶联，进而转移进入细胞核，通过Maf与ARE结合，启动ARE结合以增强抗氧化酶基因的表达，增强细胞对抗氧化应激的抗性，保护细胞活性［7-8］。因此，Nrf2-Keap1复合物的解离，进而Nrf2转位入核是其与ARE相结合，增强抗氧化酶表达，进而清除ROS的先决条件。我们猜测，低氧预适应改善骨骼肌细胞内氧化还原状态可能与Nrf2-Keap1/ARE信号途径有关，但目前还未发现相关报道。

本文拟通过培养的小鼠骨骼肌卫星细胞（C2C12）作为细胞模型，COCl2模拟低氧状态，研究低氧预适应对H2O2诱导体外培养C2C12细胞损伤的影响，探讨合理的体外化学模拟低氧模式及COCl2预处理对H2O2损伤C2C12细胞的影响及其与细胞增殖的关系，为骨骼肌损伤的修复提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　主要实验试剂　DMEM培养基（Gibco），胎牛血清（四季青），COCl2、DCFH-DA（Sigma），兔抗小鼠Nrf2一抗（Santa），山羊抗兔HRP二抗、胰蛋白酶、MTT（鼎国），青/链霉素（Amresco）。

1.2　C2C12细胞培养　小鼠骨骼肌成肌细胞系C2C12细胞购自中国协和医科大学细胞中心，培养在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，置于37℃，5%　CO2、饱和湿度的CO2培养箱中（日本SANYO公司），当细胞生长至融合度为70%～80%时，将所有细胞用0.25%胰蛋白酶消化后，以细胞密度2×105/mL传入培养瓶继续培养。

1.3　COCl2、H2O2处理方式　COCl2以无血清培养基溶解。细胞传代，COCl2处理组：待细胞贴壁后加入相应终浓度的COCl2孵育24　h，根据实验要求是/否加入终浓度为0.5　mmol/L的H2O2处理6　h，提取细胞进行相关检测。对照组加入无血清培养基。

1.4　MTT　四唑盐，3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT），可被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为不溶性的蓝紫色结晶物甲瓒，而沉积在细胞中，并被二甲基桠枫（DMSO）溶解，放入酶标仪（美国BIO-RAD公司）进行检测，在波长490　nm检测其吸光度值，可间接反映细胞活性。

1.5　ROS的测定　利用荧光探针DCFH-DA进行ROS检测，细胞于96孔板中进行培养，处理后先装载DCFH-DA荧光探针，在37℃细胞孵箱内孵育30　min后收集细胞，放入荧光酶标仪（美国Turner　BioSystems公司）进行检测，激发波长488　nm，发射波长525　nm。

1.6　核内Nrf2表达的测定

1.6.1　白提取　PBS收集细胞，离心并重悬于预冷的等渗缓冲液A（10　mM　Hepes，pH　7.9，1.5　mM　MgCl2，10　mM　KCl，0.5　mM二硫苏糖醇（DTT）和0.2　mM苯甲基磺酰氟化物（PMSF））。冰浴10　min后，再次离心并重悬于冷缓冲液B（含20　mM　Hepes，pH　7.9，20%　glycerol，1.5　mM　MgCl2，0.2　mM　EDTA，420　mM　NaCl，0.5　mM　DTT和0.2　mM　PMSF），冰上孵育20　min。全细胞蛋白提取：细胞用PBS冲洗并离心，加入裂解液。提取的蛋白-80　°C储存备用，BCA法测定蛋白浓度。

1.6.2　Western　blot步骤　每孔中加入等量蛋白（10%聚丙烯酰胺凝胶）。电泳后，蛋白转入PVDF膜，含5%脱脂牛奶的TBST（Tris-buffered　saline　containing　0.05%　Tween-20）25°C封闭1　h。加入兔抗小鼠Nrf2（1：1000）多克隆抗体4°C过夜，TBST振荡冲洗3遍，每次15　min，加入山羊抗兔二抗（1：2000）。再次振荡冲洗3遍，每次15　min，参照说明加入ECL（enhanced　chemi-luminescence）发光液，暗室显影。

1.7　数据的统计学分析　实验数据用统计分析软件SPSS　11.5进行统计处理，各数据以均值±标准差（　X±s）表示，并进行单因素方差分析，P

2　结　果

2.1　确定COCl2预处理浓度　实验分为对照组、5、10、25、50、100、150、200、250、300　μmol/L　COCl2处理组，结果如图1所示。各实验组吸光度与对照组比值分别为0.951、0.913、0.846、0.809、0.768、0.743、0.711、0.689、0.631（初始数据见表1-MTT1），表明COCl2抑制C2C12细胞的增殖，且呈剂量依赖性，与对照组相比，COCl2浓度≥25　μmol/L，差异具有显著意义（P＜0.05）。这表明，COCl2浓度＜25　μmol/L可能是适合的化学模拟低氧的预处理浓度。

2.2　COCl2预处理对C2C12细胞活性的影响　加入终浓度0.5　mmol/L的H2O2处理C2C12细胞，实验分为对照组、H2O2组、5、10、25、50　μmol/L　COCl2预处理组。如图2所示，各实验组吸光度与对照组比值分别为0.768、0.895、0.894、0.773、0.688（初始数据见表1-MTT2），实验组与H2O2组比较，5、10、25　μmol/L　COCl2预处理组细胞活性均有改善；

5、10　μmol/L　COCl2预处理组细胞活性增加具有统计学意义（P＜0.05）。

2.3　COCl2预处理对C2C12细胞内ROS含量的影响DCF法检测C2C12细胞内荧光强度，实验分为对照组、H2O2组、5、10　μmol/L　COCl2预处理组，结果如图3。与对照组相比，H2O2组C2C12细胞相对荧光强度由1.0增至4.35。5、10　μmol/L　COCl2预处理组，相对荧光强度分别为2.51和2.79（初始数据见表1-ROS），5、10　μmol/L　COCl2预处理组与H2O2组相比，细胞内ROS含量下降明显（P＜0.05），其中5　μmol/L　COCl2预处理组ROS含量减少更为明显。

2.4　COCl2预处理对C2C12细胞核内Nrf2蛋白含量变化的影响　Western　blot法检测C2C12细胞核内Nrf2含量，实验分为对照组、H2O2组、5、10　μmol/L　COCl2预处理组。如图4所示，对照组Nrf2蛋白含量极少。与对照组相比，加入H2O2处理后，细胞核内Nrf2含量有所增加。而5、10　μmol/L　COCl2预处理组与H2O2组相比，核内Nrf2蛋白含量均出现进一步明显增加，其中5　μmol/L　COCl2预处理组增加更加明显。

3　讨　论

3.1　COCl2预处理对C2C12细胞增殖的影响　骨骼肌损伤后，骨骼肌卫星细胞会被激活，提供足量的细胞核，增殖、分化，最终融合形成新的骨骼肌细胞以修复受到损伤的肌纤维。小鼠骨骼肌卫星细胞（C2C12）是广泛应用于细胞生长、分化、损伤、保护等研究的骨骼肌细胞模型［9，　10］。与原代培养骨骼肌卫星细胞相比，C2C12细胞均一、容易培养和获得，更有利于通过改变特定细胞信号传导通路上的关键环节，进一步对其细胞及分子机制进行深入研究。然而，既往诱导骨骼肌卫星细胞增殖的研究多集中在细胞因子领域。自2001年，Csete等通过研究低氧对骨骼肌卫星细胞的影响，发现适度低氧可以促进骨骼肌卫星细胞增殖［11］。孙胜等也发现，COCl2化学缺氧可对培养分化的SH-SY5Y细胞缺氧损伤过程起到保护作用［12］。此后，物理因素的影响逐渐受到人们的重视，人们设想低氧环境可能更有利于骨骼肌卫星细胞的增殖与分化。因此，能否建立一个稳定的细胞低氧预适应模型，对低氧适应保护骨骼肌细胞的机制研究具有重要的意义。

COCl2预处理常用于体外诱导细胞缺氧，在细胞增殖、分化及应激反应研究中得到广泛的应用。本研究采用CoCl2进行化学药物缺氧预处理，以探明对于C2C12细胞适宜的预处理浓度。结果显示，与对照组相比，COCl2对体外培养的C2C12细胞增殖具有抑制作用，且呈剂量依赖性，COCl2浓度≥25　μmol/L，差异具有显著意义（P＜0.05）。这表明，要选择COCl2进行体外培养骨骼肌卫星细胞进行模拟低氧的实验，低浓度的COCl2是适宜的选择。为进一步探明低浓度COCl2预处理是否对C2C12细胞氧化损伤具有保护作用。本研究在利用COCl2模拟低氧预适应后，加入H2O2诱导氧化性损伤。结果发现，5、10　μmol/L浓度的COCl2预处理对H2O2诱导的C2C12细胞活性损伤具有明显改善作用。这进一步表明，体外培养C2C12进行化学模拟低氧时，要考虑COCl2的作用浓度。

总之，体外培养C2C12进行化学模拟低氧时，要考虑COCl2的作用浓度，低浓度COCl2预处理可改善H2O2诱导的C2C12细胞活性损伤。

3.2　COCl2预处理对H2O2诱导C2C12细胞氧化损伤的影响　活性氧的产生在需氧生物生命过程中是一个正常现象，如运动导致活性氧水平在血液中和肌肉中都有所增加，其生成的主要来源是通过线粒体电子传递链，细胞质中的NADH氧化酶、黄嘌呤氧化酶、膜结合酶如NADPH氧化酶等引起。在生理条件下，这些活性氧大多数可以被细胞内的抗氧化系统清除［13，　14］。当骨骼肌细胞处于运动等氧化应激状态时，活性氧生成速度大于抗氧化系统的清除速度，造成活性氧在细胞的累积，对细胞内核酸、蛋白和糖类构成广泛危害，进而在骨骼肌损伤过程中发挥促进作用。Hansen等通过对对C2C12肌管的研究发现，适度低氧可通过改善细胞内氧化还原环境促进老化的骨骼肌卫星细胞再生［15］。邵国等研究发现，用氯化钴预处理小鼠神经细胞可通过降低细胞内ROS含量改善细胞活性［16］。

本研究在离体培养的C2C12细胞中加入H2O2诱导氧化应激，进而观察COCl2预处理模拟低氧状态对其影响。结果发现，与对照组相比，H2O2组C2C12细胞相对荧光强度显著增加。5、10　μmol/L　COCl2预处理组与H2O2组相比，细胞内ROS含量下降明显，其中5　μmol/L　COCl2预处理组ROS含量减少更为明显。这表明，加入H2O2能够在C2C12细胞诱导显著氧化应激，低浓度COCl2预处理模拟低氧状态能够明显抑制H2O2诱导的ROS产生。

3.3　COCl2预处理减轻H2O2诱导的氧化损伤可能与C2C12细胞内Nrf2激活有关　Nrf2是细胞调节抗氧化应激反应的重要核转录因子，在多种组织和细胞，包括骨骼肌细胞中广泛表达。生理情况下，Nrf2与其抑制因子Keap1相结合，使活性处于相对抑制状态。在细胞处于氧化应激时，Nrf2与Keap1解偶联，进而转移进入细胞核，通过Maf与ARE结合，启动ARE结合以增强抗氧化酶基因的表达，增强细胞对抗氧化应激的抗性，保护细胞活性［17，　18］。因此，Nrf2-Keap1复合物的解离，进而Nrf2转位入核是其与ARE相结合，增强抗氧化酶表达，进而清除ROS的先决条件。Franco等研究发现小鼠骨骼肌细胞内氧化还原状态的改善伴随有抗氧化酶基因表达的改变［19］。Liu等研究发现，Nrf2蛋白激活后可通过增强ARE控制的抗氧化酶活性改善细胞内氧化还原状态［20］。我们猜测，低氧预适应改善骨骼肌细胞内氧化还原状态可能与Nrf2-Keap1/ARE信号途径有关，但目前还未发现COCl2诱导所致Nrf2激活相关报道。

本研究通过检测C2C12细胞核内Nrf2蛋白含量发现，对照组C2C12细胞核内Nrf2蛋白含量很少。与对照组相比，H2O2组细胞核内Nrf2蛋白含量有所增加，提示H2O2引起的氧化应激状态使Nrf2激活。5、10　μmol/L　COCl2预处理组与H2O2组相比，核内Nrf2蛋白含量增加更为明显。这提示COCl2预处理能进一步增强Nrf2的激活，提高C2C12细胞抗氧化能力，是其发挥抗氧化效应的机制之一。

3.4　实践中的指导意义　目前，多项研究已显示，骨骼肌卫星细胞在骨骼肌生长发育、损伤修复和重塑中的重要作用。但在低氧条件下骨骼肌卫星细胞从静息到激活、增殖过程中具体分子调控机制仍未完全清楚。Saxena　S和Singh　M的研究表明，低氧预处理能够增强耐力并保护骨骼肌或心肌免受运动诱导的氧化性损伤［21，　22］。Safdar　A等的研究进一步表明，静坐少动老年人骨骼肌细胞内Nrf2-Keap1氧化应激信号功能障碍［23］。本研究通过化学模拟低氧处理小鼠骨骼肌卫星细胞，研究其对H2O2损伤的C2C12细胞是否具有保护作用，探讨合理的体外化学模拟低氧模式及其保护机制。旨在明确体外培养C2C12细胞进行化学模拟低氧实验时应采用的COCl2浓度，对骨骼肌卫星细胞及低氧预适应改善运动训练调控机制的深入研究，并为临床上治疗和预防骨骼肌衰减、萎缩等退行性疾病提供理论基础和实验依据。

值得注意的是，在本研究中我们只观察到低浓度COCl2预处理能有效减少H2O2引起C2C12细胞内ROS的产生，且这可能和Nrf2蛋白的激活有关，要继续进一步明确缺氧预处理的分子机制，下一步尚需检测Nrf2蛋白是如何被激活且激活后具体何种下游抗氧化酶转录增加和活性增强的相关研究，以期针对其保护机制对临床各类骨骼肌损伤相关疾病进行干预，为这些临床防治和康复工作提供新的思路和方法。

4　结　论

体外化学模拟（COCl2）低氧培养骨骼肌成肌细胞（C2C12）时，要考虑COCl2的作用浓度，COCl2浓度＜25　μmol/L可能是适合的化学模拟低氧的预处理浓度。COCl2预处理（5、10　μmol/L）可有效降低H2O2诱导C2C12细胞内ROS含量，进而改善细胞活性。低浓度COCl2预处理减轻H2O2诱导的C2C12细胞氧化应激损伤可能是通过激活核转录因子Nrf2完成的。

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