濒危药用植物八角莲菌根的显微结构观察

[摘要] 内生真菌在其宿主植物生长过程中扮演着重要的角色。为了探讨濒危植物八角莲菌根的结构及内生真菌的分布情况，对其野生植株菌根进行了显微结构的观察。结果表明，野生八角莲植株与内生真菌关系密切，其根中定殖着2种不同形态的真菌；真菌主要分布于表皮层和皮层，其中皮层中分布着膨大的菌丝结构。研究结果为八角莲属植物菌根结构及其与宿主相互作用的系统研究提供了参考。

[关键词]八角莲；内生真菌；膨大菌丝

八角莲Dysosma versipellis系小檗科八角莲属多年生草本植物，其干燥根茎作为中药材在我国应用历史悠久，早在《神农本草经》中即以“鬼臼”之名列为下品，其后历代本草均有收载，具有化痰散结，祛癖止痛，清热解毒之功效[1]。现代药理化学研究表明，八角莲的主要活性化学成分为鬼臼毒素类木脂素，是依托泊苷（etoposide，VP-16）和替尼泊苷（teniposide，VM-26）等抗癌药物合成前体――鬼臼毒素（podophyllotoxin，PTOX）的传统主要植物来源之一[2-3]。由于过度采挖、生境破坏和植物自身生长缓慢等原因，野生八角莲资源濒危[4]，深入开展八角莲的原生境保护、野生抚育及人工栽培，对于缓解野生八角莲资源供需矛盾有重要意义。

研究表明，目前所有被研究过的植物均分离到内生真菌[5]。在长期的协同进化过程中，内生真菌与宿主系形成了密切的共生关系，一方面内生真菌可提高宿主植物应对各种生物和非生物胁迫的应激能力，促进植物生长发育；另一方面，植物则为真菌提供生长所需的营养物质及生长环境。因此，鉴于内生真菌可促进宿主生长、提高其抗性等特性，以及通过人工栽培解决濒危药材八角莲可持续利用的紧迫性，本实验从野生八角莲根中分离获得了68株真菌，为系统研究八角莲内生真菌与宿主的相互作用关系，积累了可利用的候选菌株。

1材料与方法

1.1植物

实验用野生八角莲D. versipellis根和根茎，采自广西壮族自治区桂林市永福县。八角莲植物由谭小明博士鉴定。

1.2石蜡切片制作

选取无病虫害根，流水下冲洗干净，切取3～4 mm的小段，于装有3 mL FAA的安瓿瓶中固定，密封抽气后放置过夜。常规石蜡切片法制片后，采用德国Leica全自动切片机连续切片，切片厚度为12 μm，番红-固绿对染，中性树胶封片，Leica生物显微镜观察拍照。

1.3压片

参照刘润进和陈应龙[6]的方法并加以改进，主要包括材料透明、染色和分色3个步骤：将经过FAA固定的根剪成0.5～10 mm小段，放入试管中，加入适量10%KOH溶液，90 ℃水浴30 min。然后用吸管除掉KOH溶液，蒸馏水反复冲洗3次，适量0.05%乳酸酚翠盘蓝染色后，90 ℃水浴20 min。加热染色后，加入蒸馏水反复冲洗3次，进行分色；取出分色好的材料，置于洁净的载玻片上，盖上盖玻片后，在显微镜下观察和拍照。如需长期保存，可采用甘油明胶封固剂封片。

2结果

2.1八角莲根的解剖特征

2.1.1八角莲根茎的横切面结构 八角莲根茎由表皮组织、皮层薄壁组织及分布在薄壁组织中的维管组织组成。根茎最外面为1层表皮细胞，扁长方形，细胞壁木质化增厚。紧贴表皮层的是1～2层外皮层细胞，排列疏松。外皮层下方有1～3层石细胞，紧密排列成环带状，石细胞呈类圆形、类方形、切向椭圆形或三角形，细胞壁木质化增厚，胞腔小，纹孔清晰，切片经番红-固绿染色后呈鲜艳的红色。皮层薄壁组织由20～30层薄壁细胞组成，薄壁细胞排列疏松，细胞间隙较大，细胞大小不一，类圆形，细胞内含有大量淀粉粒，在光镜下可见淀粉粒常带有1个黑点。维管束外韧形，韧皮部常呈压缩状，三角形，形成层不明显，木质部导管多径向排列。髓部宽广，由薄壁细胞组成（图1）。

1.根茎横切面（bar 500 μm）；2.根茎横切面局部放大，示石细胞（bar 20 μm）；3.根茎横切面局部放大，示维管束（bar 100 μm）；4.根横切面，示表皮层、皮层和内皮层及维管束（bar 500 μm）。

图1 八角莲根及根茎的显微结构图

Fig.1 Microscopic structure of the root and rhizome of Dysosma versipellis

2.1.2八角莲菌根基本结构 八角莲的根通常从根茎维管组织产生，由表皮层、皮层、内皮层、维管束和髓组成。表皮由1层表皮细胞构成，近长方形，外壁及径向壁增厚，未木栓化。皮层位于表皮层内侧，由基本分生组织发育而来。皮层由16～19层薄壁细胞组成，所占根径的比例达80%以上，细胞间隙明显，细胞壁增厚，有木化纤维散生其中，富含草酸钙簇晶体和不定型晶体，内皮层明显，未见凯氏带。维管束由初生木质和韧皮部组成，初生木质部与韧皮部五原型，间隔排列，导管类圆形，木质化。中央为髓部，由细胞壁强烈增厚并木化的木纤维构成。

2.2八角莲内生真菌的分布

通过采用压片法和连续石蜡切片法观察八角莲菌根的结构，发现八角莲根中分布着无隔真菌和有隔真菌，两者菌丝的形态特点明显不同（图2）。

在根的表皮细胞中分布有大量菌丝，常附着一些着色较深的碎屑，碎屑附近的细胞常不完整，真菌往往能通过此处侵入到根的皮层内。侵入皮层的菌丝在皮层细胞内横向和纵向生长，横向生长的菌丝发生分叉伸入到中部和内部皮层细胞，纵向生长的菌丝沿根系的纵向在细胞间隙中生长。侵入八角莲根中的真菌呈现两种不同的形态，一种菌丝分枝众多，无横隔膜，有时还能在皮层细胞内产生孢囊；另一种菌丝具有明显的横隔膜，菌丝侵入将要定殖的皮层细胞后，菌丝顶端下方的细胞会逐渐膨大，有时会从横隔膜处产生膨大的菌丝，膨大的菌丝细胞不断进行分枝生长，产生更多膨大的菌丝细胞，最终充满整个细胞腔（图2）。皮层细胞腔中的菌丝细胞直径往往能膨大到原菌丝的3～4倍（d=10～12 μm），膨大的菌丝细胞形状不一，多为圆形和椭圆形。旺盛生长期的膨大菌丝细胞经乳酸芬翠盘蓝染色后呈蓝色，经番红固绿后呈绿色。膨大的菌丝细胞在充满整个细胞腔后，会产生新的正常菌丝侵染下一个皮层细胞，并同样产生膨大的菌丝细胞将细胞腔充满，从而形成几个连续被膨大菌丝细胞充满细胞腔的细胞。但是，由于八角莲根皮层细胞的吞噬作用，菌丝的扩展会很快被阻断，菌丝只能侵染少量皮层细胞并形成临时的侵染区，便失去了活动的可能性。从图2可见，受菌丝侵染的细胞核常膨大，常被膨大的细胞群包围，细胞膜呈现出质壁分离现象，这是植物细胞抵抗或消解菌丝侵入的应激反应。菌丝只分布于木质部以外的皮层和表皮中。在根茎中，真菌菌丝也仅分布于薄壁组织以外的栓皮层细胞中。皮层作为八角莲根中所占比例最大的组织，是真菌定殖和侵染的主要区域，它通过消化侵入的菌丝为植物生长提供营养；同时，真菌与植物在消化与反消化的相互作用过程中，也会获得菌丝生长所需的营养，从而确立并维持真菌与植物的共生关系，进而形成菌根共生体。

3讨论

本文从细胞学的角度阐明了广西野生八角莲根的显微结构，其与已报道的八角莲属的根相似[7]。根茎由表皮组织、皮层薄壁组织及维管组织构成。外层分布有大量石细胞，环带状排列；皮层占八角莲根比例的80%以上，是贮藏鬼臼毒素等物质的主要场所；维管束外韧形，形成层不明显，木质部导管多径向排列。根从根茎维管组织产生，由表皮层、皮层、内皮层、维管束和髓组成；维管束五原型，与大多数八角莲属植物的维管束类型相同，可作为八角莲分类鉴定的依据。

在本研究中，笔者还发现侵入八角莲根的真菌菌丝能在某些皮层细胞中定殖，真菌从横隔膜处产生膨大的菌丝，且膨大的菌丝细胞能不断进行分枝生长，产生更多膨大的菌丝细胞，最终充满整个细胞腔。这种现象不仅在八角莲野生菌根中存在，在美登木野生菌根和人工栽培的铁皮石斛菌根中也发现有类似现象[8-9]。邢晓科等[9]认为皮层细胞可能作为一个暂时的营养贮藏场所，即菌丝自皮层内吸收的营养经临时贮藏后再输送到根外菌丝，或者是作为菌丝侵染根的一个侵染源，当侵入皮层的菌丝老化或被植物体消化吸收后，再从这里产生新的菌丝往复侵染。Clements的研究也支持这一观点，其认为膨大菌丝是菌丝被植物组织消解前的一种肿胀形式，如兰科菌根真菌菌丝在某一营养阶段产生的念珠状细胞[10]。但目前对其具体作用机制尚不明确，有待进一步的研究。

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[4] Xu X Q， Gao X H， Jin L H， et al. Antiproliferation and cell apoptosis inducing bioactivities of constituents from Dysosma versipellis in PC3 and Bcap-37 cell lines[J]. Cell Div， 2011， 6：14.

[5] Aly A H， Debbab A， Proksch P. Fungal endophytes： unique plant inhabitants with great promises[J]. Appl Microbiol Biot， 2011， 90（6）： 1829.

[6] 刘润进，陈应龙.菌根学[M]. 北京：科学技术出版社，1997.

[7] 陈黎，陈吉炎，安志斌，等. 八角莲的性状与显微鉴别[J]. 中药材，2004，27（8）：558.

[8] 谭小明，郭顺星，周雅琴，等. 美登木根的显微结构及其内生真菌的分布[J]. 植物学通报，2006，23（4）：368.

[9] 邢晓科，郭顺星，陈晓梅，等. 人工栽培铁皮石斛菌根的细胞学研究[J]. 菌物学报，2005，24（4）：88.

[10] Clements M A. Orchid mycorrhizal associations[J]. Lindleyana， 1988， 3： 73.

Microscopic observation on mycorrhiza of rare herb Dysosma versipellis

TAN Xiao-ming， YU Li-ying， ZHOU Ya-qin*， ZHOU Xiao-lei， WEI Ying

（National Engineering Laboratory of Southwest Endangered Medicinal Resources Development，

National Development and Reform Commission， Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant， Nanning 530023， China）

[Abstract] Endophytic fungi played an important role in the growth of its host plant. To investigate the mycorrhizal characteristics and the distribution of fungi in the root， an endangered wild plant-Dysosma versipellis was collected and observed by electron microscope. The results showed that the host was closely associated with endophytic fungi. The fungi were mainly distributed in the epidermis and cortex. The aseptate and septate fungi with swollen hyphae were observed in some cell of the cortex. The result provides a reference for the study of mycorrhizal structure of Dysosma genus and the interaction between the fungi and its host.

[Key words] Dysosma versipellis； endophytic fungi； swollen hyphae

doi：10.4268/cjcmm20132310