SSR分子标记技术在茄子杂交种子纯度鉴定中的应用

摘要：利用SSR分子标记技术进行种子纯度鉴定是一种准确快速、简单高效的方法。试验选用100对引物在鄂茄子2号亲本间进行PCR扩增，从中筛选出的3对引物SM17、SM29、SM51在双亲本间能够扩增出差异互补的条带。利用这3对引物对鄂茄子2号杂种一代群体进行纯度鉴定，鉴定结果为97.1%；与同批次种子的田间鉴定结果（96.1%，鉴定地点海南岛）接近，说明应用SSR分子标记技术实施茄子杂种一代种子的纯度鉴定是可行的。

关键词：茄子；SSR分子标记技术；种子纯度；鉴定

中图分类号：S641.1；Q503；S339.3+1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）08-1959-04

种子纯度鉴定是种子质量保证的关键环节，直接影响到作物的产量和品质。传统的种子鉴定方法主要有种子形态鉴定法、幼苗鉴定法和田间小区种植鉴定法[1]，这些方法不仅需要较多的土地、劳力与财力，而且很容易受到环境因素的干扰，同时鉴定结果的准确性往往不高[2，3]。简单重复序列（Simple sequence repeat，SSR）是近年来发展起来的一种DNA分子遗传标记技术，该技术采用聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）完成检测，所需的DNA样品量少，对DNA质量要求也不高，加之SSR呈共显性遗传，可鉴别杂合子与纯合子；并且多态性丰富、重复性好、结果稳定可靠[4-7]，因而受到普遍欢迎，应用的农作物种类不断增加。SSR技术既有限制性内切酶片段长度多态性技术（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）的稳定性高和共显性强的优点[6，8，9]，又比随机扩增的多态性DNA标记技术（Randomly amplifiled polymorphic DNA，RAPD）成本低、技术简单[10]，所以在种子纯度鉴定中的应用非常广泛，已在水稻（Oryza sativa L.）[11-13]、小麦（Triticum aestivum L.）[14-20]、玉米（Zea mays L.）[21-25]、棉花（Gossypium spp.）[26-31]、大豆[Glycine max（L.）Merr.][32-35]、油菜（Brassica napus L.）[36，37]、花生（Arachis hypogaea L）[5，38，39]、向日葵（Helianthus annuus L.）[40]、苜蓿（Medicago sativa L.）[41，42]、西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum. et Nakai.] [43]、甜瓜（Cucumis melo L.）[44]、黄瓜（C. sativus L.）[3，45]、大白菜[B. campestris L. ssp. pekinensis（Lour.）Olsson][46，47]、甘蓝（B. oleracea L. var. capitata L.）[48]、辣椒（Capsicum annuum L.）[49]、 番茄（Solanum lycopersicum L.）[50]、马铃薯（S. tuberosum L.）[51]、莲藕（Nelumbo nucifera Gaertn.）[52]等农作物、蔬菜种子中都有报道。试验通过从美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库和相关文献报道中筛选合适的SSR引物，完成鄂茄子2号（Solanum melongena L. cv. E- Qiezi No.2）种子纯度的鉴定，以期为准确快速、简单高效的茄子杂交种纯度鉴定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及处理 供试植物材料鄂茄子2号与其母本HLE-1、父本HLE-9均由武汉汉龙种苗有限责任公司提供，采用穴盘播种法育苗，在幼苗出现3～4片真叶时采集叶片，用液氮冷冻后放入冰箱（-70 ℃）内保存备用。

1.1.2 试剂 2×CTAB DNA提取缓冲液由2%CTAB、2%PVP、100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、25 mmol/L EDTA、2.0 mol/L NaCl组成；TE由10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA组成，用于DNA的溶解及保存，使用时添加RNase A 至终浓度为20 ng/mL；电泳缓冲液10×TBE由Tris 108 g、硼酸55 g、0.5 mol/L EDTA 40 mL加水至1 000 mL组成，工作浓度为0.5×TBE；Taq DNA聚合酶、dNTPs、分子量Marker为宝生物工程（大连）有限公司产品；其他各种化学试剂如氯仿、异戊醇、AgNO3、异丙醇、乙醇、NaAc等均为国产分析纯。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司提供，引物编号SM1-SM100。

1.1.3 仪器 主要有2720-PCR仪（美国ABI公司）、FR-980生物电泳图像分析系统（上海复日科技有限公司）、DYY-6C型全自动三恒多用电泳仪（北京市六一仪器厂）、DYCZ-28C垂直电泳槽（北京市六一仪器厂）、SPECORD200型紫外-可见光分光光度计（德国耶拿分析仪器股份公司）、GL21R高速冷冻离心机（上海知正离心机有限公司）、HH-8B数显恒温水浴锅（江苏省金坛市环宇科学仪器厂）、SW-CJ-1A 超净工作台（江苏省吴江市隆聚净化科技有限公司）、DHG-9420A-电热鼓风干燥箱（上海申贤恒温设备厂）等。

1.2 方法

1.2.1 茄子叶片DNA的提取 采用CTAB法[53]，随机选取鄂茄子2号F1幼苗150株，父本HLE-9、母本HLE-1各1株；每份材料取0.2 g叶片样，剪碎后放入2 mL EP管内（100 μL 的2×CTAB 加钢珠1颗）；在磨样器上将叶片打碎，加入700 μL的 2×CTAB混匀；65 ℃ 水浴1 h，每10 min上、下轻微颠倒一次；加入800 μL氯仿-异戊醇（24∶1，体积比，下同）混匀后于4 ℃、10 000 r/min离心10 min；取上清液于新的EP管中，再加入等体积的氯仿-异戊醇抽提一次；复取上清液于新的EP管中，加入等体积的异丙醇（约500 μL，-20 °C预冷）和1/10体积的3 mmol NaAc（约50 μL），混匀后于-20 ℃沉淀1 h；4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清液，收集沉淀并风干；用700 μL 75%的乙醇洗涤沉淀2次，4℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清；加入200 μL TE（pH 8.0）溶解沉淀DNA，并加入1 μL 10 mg/mL RNaseA于37 ℃的电热鼓风干燥箱中放置1 h，以去除残留的RNA；用紫外-可见光分光光度计检测DNA浓度，将提取的DNA浓度调至100 ng/μL，置于-20 ℃保存备用。

1.2.2 SSR引物的筛选 ①从NCBI数据库中挑选多态性较高的SSR引物100对[54]。②将引物用灭菌的去离子水溶解至 10 μmol。③PCR扩增，反应体系15 μL，包含1.50 μL 10×PCR Buffer、0.30 μL dNTPs（10 mmol）、0.25 μL Primer F（10 μmol）、0.25 μL Primer R（10 μmol）、0.20 μL Taq DNA聚合酶（相当于2.5 U/μL）、11.50 μL去离子水、1 μL DNA（100 ng/μL）。④PCR反应条件为94 ℃预变性10 min；94 ℃变性40 s，设置温度梯度52～60 ℃，退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。⑤PCR反应产物用琼脂糖凝胶预检测其扩增效果，并确定每对引物的最适退火温度。⑥调整好最适退火温度，分别以鄂茄子2号的父本、母本DNA为模板再次进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物，找出能区分父本和母本的特异性引物。

1.2.3 F1代种子纯度检测 用筛选确定的特异引物进行鄂茄子2号F1群体检测（反应体系和条件同上）；将扩增后的PCR产物先用琼脂糖凝胶预检测，以确定PCR扩增是否成功；然后将PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，AgNO3染色后拍照。

1.2.4 田间种植纯度鉴定 2011年秋季在海南岛试验基地采用营养钵播种，幼苗5～6片真叶时定植，行株距60 cm×50 cm，鄂茄子2号定植110株，其双亲各定植10株，常规栽培管理。在植株对茄期通过植株和果实特性的调查来比较各方差异，从而进行鄂茄子2号的纯度鉴定。

2 结果与分析

2.1 特异引物的筛选

用100对SSR引物对鄂茄子2号的双亲进行引物筛选，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测进行扩增，结果见图1。由图1可见，筛选到的引物SM17、SM29、SM51扩增带在父本和母本间出现互补条带，3对引物序列如下：

SM17——F链5′-ATCAATGACACCCAAAACC

CATTT-3′；R链5′-GTTTGAAAACCCAATACAAAT

CCGA-3′。SM29——F链5′-ATTGTGTCGATGAG

ATTTTGGTCA-3′；R链5′ GTTTAGCTACGTTGGTT

TGGTGCTGAA-3′。SM51——F链5′-AGTCCACCA

TGAGTGAGTGAGTGA-3′；R链5′-GTTTACGTGTT

GGGCCTCCAAAATATC-3′。

这个结果说明3对引物可以区分父本和母本，因而可用于鄂茄子2号种子纯度的检测。

2.2 F1种子纯度的检测

提取鄂茄子2号的F1样品DNA，经检测最终获得140份可用样品。用上述3对引物分别进行样品PCR扩增检测，其中引物SM17和SM29纯度鉴定结果一致，因此选用引物SM17进行鄂茄子2号的纯度检测，结果见图2。试验在140份样品中出现了4个同父本的单条带，说明这4株为杂株，剩下的为纯合F1代，因此被鉴定的鄂茄子2号种子纯度为97.1%。

2.3 田间纯度鉴定

在海南岛试验基地种植的鄂茄子2号最后存活植株103株，当茄果达到正常商品果时统一进行性状调查，通过比较株型、叶型、果型、果色、萼片色等表型性状对群体进行纯度鉴定，经检测确定杂株4株，因此计算其纯度检测结果为96.1%，这与SSR技术检测的结果接近，说明SSR技术能够用于茄子F1代种子纯度的快速检测。

3 讨论

试验利用SSR技术实施鄂茄子2号种子纯度的鉴定，结果与田间鉴定结果保持了较好的一致性，说明利用SSR技术替代田间种植观察完成茄子种子纯度的快速检测是可行的，有望克服田间调查周期长、受环境因素干扰较大等问题。

试验在NCBI数据库中下载了100对SSR引物，但从中仅筛选出了3对有用的引物，其利用率相当低；而在同种作物、不同品种间由于亲缘关系较近，SSR表现出来的多态性都较差，因此在种子纯度鉴定中SSR引物筛选的难度还是比较大的。同时，此技术前期开发新的SSR引物费时耗力，并且成本高，使得SSR技术在实际运用中受到了一定的限制。不过随着NCBI数据库的不断扩大和研究者的不断挖掘，更多的SSR位点将被标记出来，进而开发成本也会降低。所以有理由相信SSR技术在种子纯度鉴定方面的应用前景广阔。

参考文献：

[1] 王从彦，胡 颖，郭二辉，等.农作物种子纯度鉴定方法综述[J].现代农业科技，2006（24）：10-13.

[2] 潘显政，支巨振，梁志杰，等.农作物种子检验员考核学习读本[M].北京：中国工商出版社，2006.223-245，273-277.

[3] 张桂华，李家旺，张文珠.利用SSR技术对黄瓜新品种津优35号进行种子纯度鉴定[J].北方园艺，2010（12）：140-141.

[4] 罗玉娣，李建国.SSR标记及其在蔬菜育种中的应用[J].热带农业大学学报，2005，25（6）：68-71.

[5] 张建成，王传堂，杨新道.SSR和STS在花生栽培品种鉴定中的应用研究[J].植物遗传资源学报，2006，7（2）：215-219.

[6] 周延清. DNA分子标记技术在植物研究中的应用[M]. 北京：化学工业出版社，2005.

[7] 朴红梅，王玉民，刘宪虎，等.简单重复序列的研究与应用[J].吉林农业科学，2004，29（6）：11-15.

[8] 吕英民，王秀芹.RFLP在园艺作物上的应用[J]. 河北农业科学，1994（4）：28-31.

[9] 贾继增，张正斌，DEVOS K，等.小麦21条染色体RFLP作图位点遗传多样性分析[J].中国科学（C辑：生命科学），2001， 31（1）：13-21.

[10] 王鸣刚，谢 放，郭小玲.利用RAPD方法鉴定西瓜杂种纯度的研究[J].厦门大学学报（自然科学版），2003，42（1）：112-116.

[11] 彭锁堂，庄杰云，颜启传，等.我国主要杂交水稻组合及其亲本SSR标记和纯度鉴定[J].中国水稻科学，2003，17（1）：1-5.

[12] 李稳香，詹良才.杂交水稻种子纯度SSR指纹图谱标记鉴定技术研究[J].中国种业，2006（3）：21-22.

[13] 谭智丹，余显权，高健强，等.利用SSR鉴定杂交水稻种子纯度的研究[J].种子，2006，25（4）：27-29.

[14] BOHN M， UTZ H F， MELCHINGER A E. Genetic similarities among winter wheat cultivars determined on the basis of RFLPs，AFLPs and SSRs and their use for predicting progeny variance[J]. Crop Science，1999，39（1）：228-237.

[15] 高睦枪，刘冬成，郭小丽，等.我国部分冬小麦新品种（系）SSR标记遗传差异的研究[J].农业生物技术学报，2001，9（1）：49-54.

[16] 陈新民，何中虎，史建荣，等. 利用SSR标记进行优质冬小麦品种（系）的遗传多样性研究[J]. 作物学报，2003，29（1）：13-19.

[17] 郭小丽，刘冬成，罗 铮，等.我国部分优质小麦品种遗传差异的SSR标记分析[J].麦类作物学报，2004，24（1）：1-5.

[18] 徐如宏，任明觅，杨英苍，等.贵州省区试小麦品系遗传多样性的SSR标记研究[J].山地农业生物学报，2005，24（1）：12-16.

[19] 李汝玉，李 群，张文兰，等.利用SSR标记进行中国小麦品种鉴定的研究[J].种子，2008，27（2）：91-94

[20] 李小军，李 淦，董 娜，等.小麦优异品系遗传构成的简单重复序列（SSR）分析[J].农业生物技术学报，2012，20（3）：235-245.

[21] SMITH J S C， CHIN E C L， SHU H， et al. An evaluation of the utility of SSR loci as molecular markers in maize （Zea mays L.）： Comparisons with data from RFLPs and pedigree[J]. Theor Appl Genet，1997，95（1-2）：163-173.

[22] 番兴明，陈洪梅，谭 静，等.利用配合力和SSR标记对热带和温带玉米自交系进行杂种优势群划分[J].西南农业学报，2003， 16（1）：1-8.

[23] 李新海，袁力行，李晓辉，等.利用SSR标记划分70份我国玉米自交系的杂种优势群[J].中国农业科学，2003，36（6）：622-627.

[24] 沈童伟，陆徐忠，刘勋辉，等.SSR标记鉴定玉米品种真实性及纯度的研究[J].安徽农业科学，2009，37（19）：8904-8908，8913.

[25] 骈跃斌，许 晶，武岩军，等.SSR分子标记技术在玉米杂种优势群划分中的应用[J]. 山西农业科学，2012，40（5）：439-441， 444.

[26] 武耀廷，张天真，郭旺珍，等.陆地棉品种SSR标记的多态性及用于杂交种纯度检测的研究[J].棉花学报，2001，13（3）：131-133.

[27] 刘勤红，王芙蓉，张 军，等.利用SSR标记鉴定鲁棉研15号杂交种纯度的研究[J].山东农业科学，2003（2）：7-9.

[28] 秦 利，李 冰，范 玲，等.新疆陆地棉SSR标记指纹图谱构建和杂种纯度鉴定研究[J].新疆农业科学，2005，42（6）：399-401.

[29] 朱美霞，李英芝，王建书，等.利用SSR方法鉴定棉花品种纯度[J].安徽农业科学，2005，33（11）：2010-2016.

[30] 吴玉香，高燕会，祝水金，等.4个栽培棉种间四元杂种的SSR分子标记鉴定[J].浙江大学学报（农业与生命科学版），2007， 33（1）：56-60.

[31] 王俊芳.基于SSR标记的棉种真实性和品种纯度鉴定技术研究[D].北京：中国农业科学院，2009.

[32] 吴晓雷，贺超英，陈受宜，等.用SSR分子标记研究大豆属种间亲缘进化关系[J].遗传学报，2001，28（4）：359-366.

[33] 关荣霞，刘 燕，刘章雄，等.利用SSR方法鉴定大豆品种纯度[J].分子植物育种，2003，1（3）：357-360.

[34] 谢 晨，谢 皓，张 芳，等.利用SSR分子标记鉴定大豆新品种北农103[J].北京农学院学报，2010，25（2）：15-17.

[35] 盛新颖，詹少华，樊洪泓，等.利用SSR分子标记鉴定“梅桥”大豆种质纯度[J].大豆科学，2010，29（2）：210-214.

[36] 沈金雄，傅廷栋，杨光圣.甘蓝型油菜SSR、ISSR标记的遗传多样性及其与杂种表现的关系[J].中国农业科学，2004，37（4）：477-483.

[37] 陆光远，伍晓明，张冬晓，等.SSR标记分析国家油菜区试品种的特异性和一致性[J].中国农业科学，2008，41（1）：32-42.

[38] 刘冠明，郑奕雄，黎国良.20个花生品种的SSR标记指纹图谱构建[J].中国农学通报，2006，22（6）：49-51.

[39] 詹世雄，郑奕雄，刘冠明，等.花生新品种汕油21种子纯度SSR标记鉴定体系的建立和应用[J].种子，2007，26（9）：18-20.

[40] 孟全业，赵建宗，李巧英，等.SSR分子标记方法鉴定杂交向日葵品种纯度研究[J].山西农业科学，2008，36（5）：42-44.

[41] 王小山，陈志宏，韩建国，等.采用微卫星（SSR）标记研究苜蓿品种鉴定初报[J].草地学报，2007，15（4）：344-347.

[42] 魏臻武，符 昕，耿小丽，等.苜蓿遗传多样性和亲缘关系的SSR和ISSR分析[J].草地学报，2007，15（2）：118-123.

[43] 艾呈祥，余贤美，刘庆忠，等.利用SSR标记鉴定西瓜杂交种纯度的研究[J].西北植物学报，2006，26（10）：40-44.

[44] 艾呈祥，余贤美，马国斌，等.甜瓜杂交种SSR指纹图谱的构建[J].果树学报，2006，23（3）：415-419.

[45] 王 全，张桂华，苗伟利.应用SSR技术进行了黄瓜杂交种种子纯度鉴定[J]. 北方园艺，2009（7）：43-44.

[46] 张 庶，周新成，李利斌，等.利用EST-SSR标记鉴定大白菜杂交种纯度的研究[J].天津农业科学，2010，16（6）：1-4.

[47] 李 丽，郑晓鹰.用于白菜和大白菜品种鉴定的EST-SSR复合标记的建立[J].园艺学报，2009，36（11）：1627-1634.

[48] 陈 琛，庄 木，李康宁，等.甘蓝EST-SSR标记的开发与应用[J].园艺学报，2010，37（2）：221-228.

[49] 白占兵，李雪峰，戴雄泽.利用SSR分子标记建立辣椒纯度鉴定体系[J]. 辣椒杂志，2011（1）：32-34.

[50] 王日升，李杨瑞，黄伟雄，等.利用SSR标记鉴定番茄种质资源[J]. 西北植物学报，2005，25（12）：2426-2430.

[51] 王绍鹏，邱彩玲，李 勇，等.马铃薯DNA提取及SSR标记分析[J].东北农业大学学报，2009，40（5）：7-12.

[52] 全志武，汪 静，潘 磊，等.10个藕莲品种SSR指纹图谱的构建与鉴别[J].中国蔬菜，2008（3）：15-17.

[53] MURRY H G， THOMPSON W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J]. Nucleic Acids Res，1980，8（19）：4321-4325.

[54] NUNOME T， SUWABE K， IKETANI H， et al. Identification and characterization of microsatellites in eggplant[J]. Plant Breeding，2003，122（3）：256-262.