核磁共振技术在植物代谢研究中的应用

摘 要 基于核磁共振技术（Nuclear Magnetic Resonance， NMR）和模式识别技术的代谢组学研究是近几年发展起来的一种新的组学技术。该文简要综述核磁共振技术用于植物代谢研究的实验设计、图谱的获取、模式识别技术及其最新应用。

关键词 核磁共振 植物代谢组学 模式识别技术

代谢组学是定量研究生物体内源性代谢物整体及其变化规律的科学， 它与基因组和基因组学、转录组和转录组学、蛋白组和蛋白组学等一起构成系统生物学（systems biology）， 是整体系统生物学（global systems biology）的重要组成部分。植物代谢组学是代谢组学的一个重要分支，很多研究集中在细胞代谢组学这个相对独立的分支。与传统植物化学研究不同，它是从整体出发，系统地、全面地研究植物中代谢产物的成分、结构、合成途径及相关的基因功能，判断基因表达水平的变化，从而推断基因的功能及其对代谢流的影响[1]。

核磁共振技术作为研究代谢组学中结构分析的一种有利工具，已经有20多年的历史，广泛应用于植物代谢、微生物代谢、药物毒性和疾病诊断中[2～5]。该方法对样品无损伤，不破坏样品的结构和性质，无辐射损伤；可在一定的温度和缓冲液范围内选择实验条件，能够在接近生理条件下进行实验；可研究化学交换、扩散及内部运动等动力学过程，给出丰富的有关动态特性信息[6]。同时，混合物中不同代谢物的核磁共振响应系数一致，属于无偏向检测技术。由于植物代谢要比微生物、药物等的代谢复杂，尤其是水生植物代谢研究很少，本文就核磁共振技术在植物代谢研究中的最新应用及所面临的主要问题进行综述。

1 代谢组分析技术与模式识别方法

1.1 代谢组核磁共振技术的分析过程

代谢组学研究一般包括4个步骤：（1）确定研究对象，给予研究对象一定的刺激，如基因的改变，体内生物过程的催化或抑制，致病或致病物质的引入，以及各种环境因素的改变和刺激时间、强度的变化等等；（2）样品的前处理，前处理方法将依赖代谢物提取方法进行选择，如氯仿提取、酸提取、水提取、甲醇提取等[7～9]；（3）用核磁共振分析手段测定其中代谢物的种类、含量等数据并对这些数据进行预处理，包括滤噪、重叠峰解析、峰对齐、峰匹配、标准化和归一化等，将这些元数据转变为适合多变量分析的数据形式，使相同的代谢产物在生成的数据矩阵中由同一个变量表示，所有样品具有相同的变量数；（4）采用模式识别和多维统计分析等方法进行数据分析，建立代谢物时空变化与生物体特性的关系，达到从不同层次和水平上阐述生物体对相应刺激响应目的。

1.2 核磁共振分析原理

核磁共振波谱是一种基于具有自旋性质的原子核在核外磁场作用下，吸收射频辐射而产生能级跃迁的谱学技术。原子核能级的变化不仅取决于外部磁场强度的大小及不同种类的原子核， 而且取决于原子核外部电子环境。在照射频率确定时， 同种核因在分子中的化学环境不同而显示吸收峰位移变化。根据不同基团中核化学位移在各自特定的区域内出现的特点，可以确定化合物分子中官能团的种类。邻近基团之间的耦合作用会导致谱峰裂分，利用这种裂分裂距的大小与形状可以进一步确定分子内部基团的连接关系，最后便可推断分子的化学结构[10]。

1H-NMR是目前研究最充分的波谱，由于氢谱灵敏度最高且所累积的数据最丰富，核磁共振的绝大部分研究工作都集中于氢谱。核磁共振氢谱能提供重要的结构信息：化学位移、耦合常数及峰的裂分情况、峰面积等。此外，核磁共振13C、31P、15N等也是近年来研究的重点。

1.3 模式识别分析方法

代谢组学数据组是多变量数据集，这就需要可视化软件、生物信息学和模式识别方法来对这些数据进行分析和处理，进而发现和确定相关生物标志物及代谢通路的变化规律。模式识别（patter recognition）是化学计量学重要组成部分，是数据信息挖掘的主要方法之一。目前，最常用的分析方法有主成分分析法[11]（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法[12]（partial least squares， PLS）。

PCA方法是采用线性投影将原来多个变量空间转换转化成一组新的正交变量统计分析方法。这些相互正交新变量称为“主成分”，是原始变量的线性组合。PCA方法主要应用于对高维数据空间进行降维，从而降低问题复杂性，在尽可能保留原有信息的基础上将高维空间中的样本投影到较低维的主成分空间中[13]，以提取基本代谢物信息，实现对数据的可视化、样本的分类聚集和异常样品的剔除。 使用PCA分析可以从数学上简化这些变量，目的就是用较少的综合性变量替代原来众多的相关性变量。

PLS本质上是一种基于特征向量的回归方法[14]。在化学计量学中主要用于回归建模（PLS-R），在很大程度上可取代多元线性回归和主成分回归。它在克服自变量多重相关性的情况下，将从样品中得到的包含独立变量的矩阵和与之相关的非独立变量的矩阵相关联[15，16]。如果将模式识别中的已知类别响应设为0或1，偏最小二乘也可用于模式识别，称为偏最小二乘辨别分析（PLS-discriminant analysis， PLS-DA），相对于PCA所得到的投影图可以获得更好的分类效果[6]。PLS-DA是目前代谢组学中应用最为主要的模式识别方法，被广泛应用于植物、药物、疾病的代谢组学研究。

除模式识别方法，统计全相关谱[17] （statistical total correlation spectroscopy， STOCSY）也有助于鉴定NMR谱中的分子结构。它利用各种强度变量具有多个共振线的优势， 从一套波谱中产生一个准2D-NMR谱， 用以显示各种峰强度与整个样品的相互关系。此方法能够进行代谢物的结构指认，尤其为单峰质子归属提供方法。

2 在植物代谢组学研究中的应用

植物代谢组学研究大多集中在代谢轮廓或代谢物指纹图谱上[18～20]。根据研究对象、目的的不同，基于NMR的植物代谢组学主要有以下几个方面。

2.1 特定种类植物代谢物组学研究

这类研究通常以某一植物为对象，选择某个器官或者组织，对其中的代谢物进行定性和定量分析。Yang等[21]通过对爵床科植物穿心莲代谢物中4种主要的萜类化合物1H-NMR的定量检测，得到结果与高效液相色谱检测结果具有很好的相关性，而且核磁共振方法简单快速，不需要建立标准曲线，非常适合穿心莲的常规控制。Soininen等[22]采用定量核磁共振技术和约束总体最小二乘法（CTLS）分析技术对黄色洋葱进行定量、定性分析并与传统的高效液相色谱-质谱连用技术进行对比，结果发现除黄酮醇类和它们的糖类衍生物由于浓度很低难于测定外，其它代谢组份均可以被检出，基于CTLS的核磁共振代谢组学方法是测定黄洋葱代谢组分浓度的一种有效方法。

2.2 不同基因型植物代谢组学表型研究

通过对2个或者2个以上的同种植物（突变型或者基因修饰型植物和正常野生型植物）进行比较和鉴别，可达到评价基因改造或者组织培养的效果、筛选优良品种等目的。Grebenstein等[23]用1H-NMR对荷兰野生胡萝卜和栽培品种西方橙色胡萝卜的幼苗进行代谢指纹分析，结果显示2种幼苗的初级代谢产物的含量，绿原酸和阿魏酰奎尼酸的浓度有所不同。但通过代谢组学方法并不能看出基因修饰与未经过修饰的胡萝卜品种的区别，显示胡萝卜对基因渗透的适应性。Ren等[24]应用核磁共振（1H-NMR）和多变量分析技术，对野生型拟南芥和转基因拟南芥进行代谢指纹分析。基于核磁共振数据的主成分分析结果表面对分类起主要贡献作用的化合物被定性为一些具体的氨基酸，如苏氨酸和丙氨酸。这种方法不需要预纯化步骤就可以区分野生型和转基因拟南芥。

2.3 生态型植物代谢组学研究

这类研究通常选择不同生态环境下的同种植物，研究生产环境对植物代谢物产生的影响[25，26]。Lucksanaporn等[27]用1H-NMR和偏最小二乘法分析日本北川东当归代谢物影响因素，发现地理差异对代谢物影响比其它因素如种植面积、种类、样品制备方法及感官质量等要明显。同时也发现与感官质量有关的代谢物受气候条件的影响比较明显。Kim等[28]对中国卷心菜和韩国卷心菜提取物进行1H-NMR和主成分分析，结果表明对2种地区卷心菜代谢组分分类起主要贡献作用的化合物被定性为4-氨基丁酸、甲酸、天冬酰氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、O-磷酸胆碱、乙酸苯酯、苯基丙氨酸、丁酸盐、蔗糖、酪氨酸和缬氨酸，这些代谢物主要受到气候和地质条件影响有所变化。

2.4 受外界刺激后植物自身免疫应答

通过化学、物理或者生物刺激引起植物代谢产物的改变， 利用基于核磁共振技术的植物代谢组学对这种变化进行全面分析与检测，找出差异，进而为植物代谢规律做出解释[29，30]。Canam等[31]应用基于核磁共振代谢轮廓分析和PCA分析技术研究伊索比亚芥黄籽和褐籽的耐盐性，发现黄籽代谢产物中色氨酸和甲酸含量增加，脯氨酸和苏氨酸也有所变化，结果表明褐籽比黄籽有更好的耐盐性。刘春光等[32]采用室内培养试验方法，研究水体中Cu2+对耐盐沉水植物川蔓藻的毒害作用。试验针对叶绿素、可溶性蛋白和POD活性3项指标进行分析，结果表明川蔓藻对低浓度铜离子的胁迫会产生一定适应性， Cu2+达到或超过5mg/L就会使川蔓藻植株的生理生化指标出现明显变化，生长也会受到抑制。

3 结语

随着细胞生物学、分子生物学、遗传学的迅速发展和对遗传标记研究的深入，NMR为研究代谢和生理生化变化提供条件，但是由于NMR技术自身的一些缺陷，造成其在代谢组学中的应用仍然处于早期发展阶段，面临着方法学和广泛应用两方面的挑战。NMR技术在代谢组学研究中应用的局限性主要是其灵敏度较低，因此提高磁场强度以及通过使用超低温探头来提高灵敏度是较好的办法[33]。另外，NMR仪器价格和维护费用都比较昂贵，在某种程度上限制该方法的普及应用。

相信随着核磁共振仪检测性能的不断提高以及与更多分离检测手段的联合，数据处理工具的不断强大，代谢组数据库的不断完善，核磁共振技术在代谢组学中的应用不论是深度还是广度都会有很大的提高。人们将会更充分认识到核磁共振技术在代谢组学中的应用优势，为动植物代谢研究、药物安全性评价、疾病的认知和环境污染评价等提供一种有力的手段。

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