时间：2022-07-26 02:03:22
摘要：胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）是一种能够引起猪传染性胸膜肺炎的细菌病原体，它给养猪业带来巨大的经济损失。外膜蛋白W（OmpW）在细菌的生命活动中起着重要作用，大量研究表明OmpW与细菌的感染、耐药性以及分子调节等都有着紧密联系，因而阐明ompW基因对胸膜肺炎放线杆菌调节机制对于该疾病的防控具有重要意义。以胸膜肺炎放线杆菌ompW基因为研究对象，成功构建自杀性质粒pEM-OmpW，为构建胸膜肺炎放线杆菌OmpW突变株以及探究ompW基因对胸膜肺炎放线杆菌分子调节机制提供了基础。
关键词：胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）；外膜蛋白W；自杀性质粒
中图分类号：Q813；S855.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）01-0157-03
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.01.040
Constructing the Suicide Plasmid of OmpW of Actinobacillus pleuropneumoniae
CHEN Xia-bing1，CHEN Jie1，FU Shu-lin1，2，HE Bin1，SHAO Zhi-yong1，YAO Yan-feng1，
YANG Wen-hai1，LIU Wu1，JIN Er-guang1，TONG Wei-wen1，TAO Bi-fei1
（1.Wuhan Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science，Wuhan 430208，China；
2.School of Animal Science and Nutritional Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China）
Abstract： Actinobacillus pleuropneumoniae is the causative agent of porcine pleuropneumonia， a highly contagious respiratory disease of pig which causes serious economic losses. Outer membrane protein W（OmpW） plays a very important role in the life activities of bacteria. A large number of studies have indicated that OmpW is closely related to bacterial infection， drug resistance and molecular regulation. Therefore， it is important to elucidate the regulation mechanism of ompW gene in the prevention and control of the disease. The ompW gene of APP was studied and the suicide plasmid pEM-OmpW was successfully constructed， which providing the basis of constructing ompW gene deletion mutant and exploring OmpW regulating the molecular pathogenesis of APP.
Key words： Actinobacillus pleuropneumoniae；OmpW；suicide plasmid
胸膜肺炎放杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）是巴斯德科放线杆菌属的一种猪呼吸道病原菌，引起猪的传染性胸膜肺炎，临床上表现为纤维素性胸膜肺炎及出血性、纤维素性、坏死性肺炎等主要病理学特征[1]。自1957年Pattison首次报道以来，该病在大多数养猪国家或地区流行，给全球的养猪业造成巨大的经济损失[2]。革兰氏阴性细菌外膜蛋白（OMPs）作为外膜中的重要成分，是细胞膜通透性与外排泵系统的直接承担者，在稳定细菌外膜的结构、适应胞内外环境和抵抗胞内杀菌机制等方面起着重要作用，与细菌的毒力有密切关[3]。在APP中ompW基因编码215个氨基酸的外膜蛋白，属于表面抗原2家族，其功能是未知的，该家族包括一些表达革兰氏阴性菌表面抗原的蛋白，为孔蛋白家族，形成桶状通道[4]。该基因在APP中高度保守，为全面了解其在不同血清型APP中的作用机制提供了方便。本试验参照已测序APP血清3型JL03菌株基因组序列，设计引物以APP 4074菌株为模板，扩增ompW基因，并对其进行测序分析。成功构建APP外膜蛋白W自杀性质粒，为构建ompW基因缺失突变菌株提供了基础，同时也为探究ompW基因对胸膜肺炎放线杆菌分子调节机制提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 限制性内切酶、Ex Taq/LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker、RNase酶均购自宝生物工程（大连）有限公司。氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）、氯霉素（Chloramphenicol，Cm）溶液均购自美国Invitrogen公司。DNA回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。胰蛋白大豆琼脂（Tryptic Soy Agar，TSA）、胰蛋白大豆肉汤（Tryptic Soy Broth，TSB）粉剂购自美国Becton Dickinson and Company公司。
1.1.2 菌株与质粒 胸膜肺炎放线杆菌血清1型4074菌株和自杀性质粒pEMOC2由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室馈赠。
1.2 方法
1.2.1 4074菌株中ompW基因上下游同源臂的测序 参照已测序APP血清3型JL03菌株基因组序列，设计引物P1、P2，以APP 4074菌株为模板，扩增ompW基因及其上下游同源臂，并对其进行测序。根据测序结果设计OmpW1/OmpW2、OmpW3/OmpW4两对引物，以APP 4074菌株为模板，PCR扩增ompW基因的上下游同源臂。对PCRa物进行检测、回收，连接到pMD-18T载体上构建T-O1和T-O2，转化DH5α菌株，提取质粒进行酶切鉴定，并送样测序。测序结果比对正确，可进行下一步试验。
1.2.2 重组转移质粒pEM-OmpW的构建 将测序正确的T-O1用限制酶XbaⅠ、SalⅠ从pMD18-T载体切下，连接到经相同酶酶切的重组转移质粒pEMOC2上，然后转化DH5α菌株，提取重组质粒pEM-O1，再将测序正确的T-O2用NotⅠ、XbaⅠ从pMD18-T载体上切下，连接到经相同酶酶切的重组转移质粒pEM-O1上，转化DH5α菌株，提取质粒鉴定正确，得到重组转移质粒pEM-OmpW。
2 结果与分析
2.1 ompW基因及上下游序列保守性分析
APP血清1型菌株4074的ompW基因及上下游序列测序结果显示，该片段与JL03、L20、AP76都有很高的同源性，分别达到99%、99%、98%（图1）。
2.2 ompW基因上下游同源臂的扩增
以APP 4074菌株基因组为模板扩增ompW基因的上下游同源臂，扩增结果得到分别为1 006、1 064 bp的片段，与预期结果大小相同。回收纯化并将目的片段连接到pMD-18T载体上，送武汉天一辉远生物科技有限公司测序。测序结果表明，与APP 4074菌株测序结果相比相似性达到100%（图2、图3）。
2.3 重组转移自杀性质粒pEM-OmpW的构建与鉴定
将构建的重组质粒pEM-O1用XbaⅠ/SalⅠ双酶切进行鉴定，得到1 006 bp左右的目的片段，与上游同源臂相符合，结果表明重组质粒pEM-O1构建成功（图4）。然后，再将构建的重组转移质粒pEM-OmpW用NotⅠ/SalⅠ双酶切进行鉴定，结果切下与目的片段（包括上下游同源臂）2 070 bp大小相符的片段，表明重组自杀性质粒pEM-OmpW构建成功（图5）。
3 讨论
ompW基因编码的蛋白OmpW属于外膜蛋白的一种，是细菌感染的主要抗原之一。大量的研究结果表明，外膜蛋白在物质运输、细菌感染过程中发挥重要作用，能够帮助菌体逃避机体免疫系统的捕杀、提高对环境的耐受。在不同的细菌中，OmpW与细菌的感染、耐药性以及分子调节等有紧密联系[5]。有研究表明，铁离子可通过转录调节子Fur来影响OmpW的表达：在大肠杆菌中上调表达[6，7]，在希瓦氏菌中下调表达[8]。此外，在霍乱弧菌中，渗透压对OmpW表达有较大的影响[9]。Hu等[10]研究了1株对头孢曲松有抗性的鼠伤寒沙门氏菌，发现OmpW可能参与这种抗生素的吸收。在肺炎克雷伯菌中也被证实是候选疫苗和药物靶标[11]。将立克次氏体的重组蛋白OmpW免疫小鼠，能够得到很好的免疫原性，减少肺部等脏器的载菌量，试管中和试验中也显示出免疫OmpW的小鼠血清，能够减少立克次氏体对内皮细胞的附着和侵染[12]。在鼠伤寒沙门氏菌中，SoxS与MarA参与调控ompW基因的表达，其缺失突变将导致ompW基因的下调表达：AraC家族的转录调控因子SoxS可激活OmpW对白枯草的抗性，而同属该家族的MarA与SoxS绑定在一起形成marsox箱，增加SoxS对ompW启动子区域结合的亲和力，共同直接调控ompW基因的表达[13]。因此，OmpW在病原菌感染、耐药性以及分子调节等过程中起着重要作用。
本研究在前期工作基础上，拟构建胸膜肺炎放线杆菌ompW基因突变株，详细研究ompW基因对胸膜肺炎放线杆菌调节机制，诠释外膜蛋白在病原微生物重要生命活动过程中全局性的网络调控机制，为今后胸膜肺炎放线杆菌新型疫苗的开发和药物靶标的筛选提供理论依据。
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