红景天苷的替代生产方法研究概况

[摘要] 红景天苷是一种具有显著生物活性的酚苷类化合物，是景天科红景天属植物的主要有效成分之一。景天属植物是红景天苷的主要天然来源，但是，其野生资源有限，红景天苷产率低，因此，探索和发展红景天苷的替代生产方法具有重要的学术价值和应用价值。该文对红景天苷的替代生产方法，包括化学与生物合成方法及途径的研究概况进行了综述，并对研究前景进行了展望。

[关键词] 红景天苷；化学合成；生物合成；综述

[稿件编号] 2013-07-28

[基金项目] 北京中医药大学自主选题项目

[通信作者] *王如峰，副教授，主要从事中药化学成分及生物转化研究，Tel： （010）84738646， E-mail： wangrufeng@tsinghua、org、cn

[作者简介] 吴秀稳，硕士研究生，主要从事药物代谢研究，Tel： （010）84738646， E-mail： wuxiuwen0725@126、com 红景天苷（salidroside）是景天科Crassulaceae红景天属Rhodiola植物的主要有效成分之一。药理研究表明，红景天苷不但具有抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗辐射、抗病毒、抗肿瘤等明显功能，而且还具有增强免疫力、延缓机体衰老、机体双向调节等功效，在军事医学、航天医学、运动医学和保健医学等方面具有十分重要的应用价值，是一种极具开发前景的环境适应药物[1]。天然红景天植物野生资源极其有限，其中红景天苷的含量极低，而且红景天苷的提取工艺复杂，这使得从天然药物中提取红景天苷的收率低且纯度差，因此发展替代生产途径十分重要，而利用化学合成方法和生物技术是发展替代生产途径的重要手段。本文对红景天苷的化学合成方法、生物合成途径及利用植物组织培养、细胞培养、生物酶法、毛状根培养技术和代谢工程技术生产红景天苷相关的细胞与分子生物学最新研究进展进行了综述。

1 化学结构

红景天苷（图1）是糖的半缩醛羟基与醇羟基脱水形成的醇苷，是一种由葡萄糖与酪醇以苷键结合而成的糖苷，酪醇为其苷元。

图1 红景天苷的化学结构

Fig、1 Structure of salidroside

2 化学合成

目前化学合成红景天苷主要有以下几种途径。

2、1 酪醇的直接糖苷化

苏联学者Troshenko A T等[2]于1969年最先报道了红景天苷的合成方法，将溴代四乙酰基葡萄糖与酪醇直接缩合并脱乙酰基，得到红景天苷（图2）。明海泉等[3]于1983年在国内首次合成了红景天苷，其工艺包括：用酪醇和溴代四乙酰基葡萄糖经缩合得中间体四乙酰基红景天苷，再脱乙酰基得到红景天苷（图3）。纪淑芳等[4]进一步用2-（对氨基苯基）乙醇制得酪醇，用过量的酪醇与溴代四乙酰基葡萄糖成苷，再脱去乙酰基，得到红景天苷，其收率达到33%（图4）。

图2 Troshenko A T的合成法

Fig、2 Synthetic method reported by Troshenko A T

图3 明海泉的合成法

Fig、3 Synthetic method reported by Ming Haiquan

2、2 酚羟基保护的酪醇糖苷化

由于酪醇分子中同时存在醇羟基和酚羟基，以酪醇直接糖苷化制备红景天苷的方法也能使酪醇中的酚羟基糖苷化，产生副反应。为了克服上述缺点，李国青等[5]、张三奇等[6]、

图4 纪淑芳的合成法

Fig、4 Synthetic method reported by Ji Shufang

邓梅等[7]分别用苄基、烯丙基或酰基先将酚羟基保护，再与溴代四乙酰基葡萄糖缩合制备红景天苷（图5～7）。

图5 李国青的反应法

Fig、5 Synthetic method reported by Li Guoqing

图6 张三奇的反应法

Fig、6 Synthetic method reported by Zhang Sanqi

图7 邓梅的反应法

Fig、7 Synthetic method reported by Deng Mei

许大艳等[8]则以对氨基苯乙醇为原料，经重氮化和水解反应制得酪醇，再与苄氯反应，其产物与溴代四乙酰基葡萄糖缩合，最后催化氢化合成了红景天苷，总收率可以达到66%～70%（图8）。

李中军等[9]以一些价廉的Lewis酸为催化剂，利用稳定性好、价廉易得的β-D-五乙酰葡萄糖作为供体，以酰基保护酚羟基的酪醇为糖基化受体进行苷化反应，得到红景天苷，其总收率为35%～50%（图9）。

图8 许大艳的反应法

Fig、8 Synthetic method reported by Xu Dayan

图9 李中军的反应法

Fig、9 Synthetic method reported by Li Zhongjun

史明明[10]以葡萄糖为起始原料，经多步反应制备4种不同的糖苷化供体，然后进行糖苷化反应，最后成功地合成了红景天苷。4种糖苷供体依次为2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖三氯乙酰亚胺酯、2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖三氯乙酰亚胺酯、2，3，4，6-四-O-α-苄基-D-吡喃葡萄糖三氯乙酰亚胺酯、1-溴-2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖。但是，该方法还存在一定的缺陷，仍需要进一步的优化。

3 生物合成

尽管化学合成红景天苷及其类似物技术已日趋成熟，但大多都需要进行选择性保护、活化或使用昂贵的金属催化剂，而生物合成具有反应条件温和，立体选择性高，反应过程简单，环境污染少等特点，在合成红景天苷方面显示出优越性。因此，红景天苷的生物合成途径和方法越来越受到关注。

3、1 生物合成途径

红景天苷的生物合成包括苷元酪醇的合成与酪醇和葡萄糖结合2个方面，可分为4个阶段：一是初生代谢产物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4-磷酸（E-4-P）经莽草酸途径形成莽草酸；二是由莽草酸再经几步酶促反应形成阿罗酸；三是由阿罗酸到酪醇的合成；四是由葡萄糖和酪醇结合形成红景天苷。在这4个阶段中，第1阶段是许多高等植物所共有的代谢步骤，是十分明确的；第2阶段的反应机制也基本被探索清楚；第4阶段植物体内的尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶（UDPglucosyltransferase，UDPGT，UGTs）以尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和酪醇为底物催化合成红景天苷；关于第3阶段，从阿罗酸到酪醇的生物合成途径，已经提出了3条可能的途径，即苯丙烷类代谢途径、酪氨酸脱羧代谢途径和酪氨酸转氨代谢途径[11]。

在苯丙烷类代谢途径中，苯丙氨酸由苯丙氨酸解氨酶（PAL）催化脱掉1分子氨后形成反式肉桂酸。反式肉桂酸在芳香环的对侧发生羟基化即转化为对-香豆酸。关于对-香豆酸转化为酪醇的途径存在两种可能性。一种可能途径是对-香豆酸由对-香豆酸脱羧酶催化直接生成酪醇；另一种更为复杂一点的可能途径是对-香豆酸先由4-香豆素辅酶A连接酶（4CL）催化生成对-香豆素辅酶A，依次由香豆素辅酶A还原酶（CCR）催化生成对-香豆醛，由香豆醛脱氢酶（CAD）催化生成对-香豆醇，最后由对-香豆醇生成酪醇。由对-香豆醇生成酪醇可能需要至少两步反应，目前还不太明确。在酪氨酸脱羧代谢途径中，酪氨酸在酪氨酸脱羧酶（TyrDC）的作用下生成酪胺，酪胺在单胺氧化酶的催化下转化为对-羟苯乙醛（4-HPAA），而在酪氨酸转氨代谢途径中，酪氨酸在酪氨酸转氨酶（TAT）的作用下生成对-羟苯丙酮酸（4-HPP），对-羟苯丙酮酸（4-HPP）在脱羧酶的作用下生成对-羟苯乙醛（4-HPAA），对-羟苯乙醛（4-HPAA）在还原酶催化下转化为酪醇，最后酪醇在葡萄糖苷转移酶的催化下与葡萄糖结合生成红景天苷[12-13]。

在上述3条途径中，苯丙烷类代谢途径是人们最容易想到的，因为酪醇分子属于典型的酚类化合物，而植物体内的大部分酚类化合物均来源于此途径，为酪醇的合成提供了碳架结构最为相似的前体化合物来源。但是在随后的研究中，马兰青等[14]证实了酪氨酸脱羧代谢途径的存在，并通过构建苯丙氨酸解氨酶基因（PALts1）植物表达载体并转化回红景天的方法发现PALts1的过表达和4-香豆酸的积累不能促进酪醇的合成，另一方面4-香豆酸生成酪醇需要脱羧反应，而植物中不存在此类反应，因此否定了酪醇来源于苯丙烷代谢途径的可能性，推断其生物合成来源于生物碱代谢途径。

3、2 生物合成方法

3、2、1 组织培养技术 利用组织培养技术生产红景天苷主要体现在红景天的组织培养上。红景天组织培养的研究工作主要集中在以下3个方面：一是对不同种类的组织培养与快速繁殖技术进行研究；二是针对不同的种类、同一种类的不同器官或组织，以及相同外殖体的不同培养阶段来筛选理想的培养基配方和培养条件的配置；三是利用组织培养方式来进行相关的其他研究，如探索红景天苷的生物合成途径、提高培养组织中红景天苷的量等。李伟等[15]对狭叶红景天和大花红景天不同外植体的组织培养进行了探索，找出了不同外植体在不同培养阶段的理想培养基配方和培养条件配置。张瑜等[16]分别以高山红景天的幼茎和幼叶作为外植体，以MS为基本培养基，研究不同激素配比对高山红景天愈伤组织的诱导、继代、生根的影响。结果发现幼茎是最佳的外植体；愈伤组织诱导最佳的培养基为 MS + 6-BA（3 mg・L-1） + NAA（0、5 mg・L-1），诱导率达83、3%；不定芽诱导和增殖的最佳培养基为 MS + 6-BA（2 mg・L-1） + NAA（0、1 mg・L-1），诱导率和增殖率高达72%，且产生的不定芽数量较多；生根培养基以 MS + IAA（0、5 mg・L-1）为最好，生根率为100%，而且幼苗长势旺盛。张雪莲等[17]以高山红景天的种子和试管苗的茎、叶为外植体诱导愈伤组织，继代培养6次，测定每代愈伤组织中红景天苷的含量，得出高山红景天中红景天苷含量与外植体和继代次数相关的结论，为培育高红景天苷植株提供了依据。

3、2、2 细胞培养技术 利用细胞培养技术生产红景天苷主要体现在红景天细胞的悬浮培养上。艾江宁等[18]研究了高山红景天悬浮细胞生长和红景天苷合成动力学特征，发现其悬浮培养的生长周期约为16 d，0～4 d为细胞的延滞期，4～12 d为对数期，13～15 d为稳定期，在第14 d细胞鲜、干质量达到最大，红景天苷含量在培养的第12 d达到最高，其质量分数为0、59%。王莉等[19]探索了基本培养基、激素、碳源、氮源等因素对长鞭红景天细胞生长和红景天苷产量的影响，确定了长鞭红景天细胞悬浮培养体系的最适培养条件，即MS培养基+BA（5、0 mg・L-1）+2，4-D（0、1 mg・L-1）+蔗糖（30 g・L-1），建立了高产红景天苷的细胞悬浮培养体系。魏欣方等[20]在红景天悬浮细胞培养起始期分别添加苯丙氨酸、肉桂酸和酪氨酸3种前体，结果3种前体在合适的浓度下均能促进细胞中红景天苷的生物合成，苯丙氨酸的最佳添加质量浓度为20 mg・L-1，肉桂酸和酪氨酸的最佳添加质量浓度均为10 mg・L-1。

3、2、3 生物酶法 利用生物酶法合成红景天苷主要体现在红景天苷合成的最后一步中，即酪醇与葡萄糖在酶的作用下脱水形成糖苷。以廉价易得的酪醇和β-D-葡萄糖为原料，采用分离纯化的糖苷酶或者筛选构建的红景天苷高转化菌株合成红景天苷。Zhang Lei等[21]首次报道了利用微生物酶合成红景天苷，从黑曲霉MS-48中分离纯化一个大小为84、6 kD的糖苷酶Salidrosidase，在p-酪醇质量浓度为15 g・L-1、β-D-葡萄糖质量浓度为60 g・L-1，温度45、8 ℃，pH 5、0的条件下反应6 h，红景天苷的产率为10%。Tong等[22]首先利用从苹果种子粗粉中提取的β-葡萄糖苷酶在二氧六环水混合体系中催化酪醇和β-D-葡萄糖合成了红景天苷，收率为15、8%。Hiroyuki Akita等[23]从杏仁粗粉中提取的β-葡萄糖苷酶在叔丁醇-水混合系统中分别与7种不同的取代醇反应，合成了一系列红景天苷类似物，产率适中，在11%～22%。王梦亮等[24-25]从红景天根系土壤中筛选出了5个菌株，通过比较5个菌株合成红景天苷的能力，确定米曲霉为合成红景天苷的出发菌株，以葡萄糖和酪醇为底物合成红景天苷；利用海藻酸钠和壳聚糖固定β-葡萄糖苷酶，催化合成红景天苷，提高了红景天苷的转化率。高雪华等[26]采用微生物固体和液体发酵法，通过硫酸铵沉淀法从黑曲霉H35和H42的发酵液中提取合成红景天苷和酪醇的红景天苷合成酶系和酪醇合成酶系，通过酶促反应提高了红景天苷和酪醇的含量。

3、2、4 毛状根培养 毛状根培养是近10年发展起来的一种新的培养系统，生长速度快、分枝多、弱向地性，有稳定的次生代谢物合成能力，因此可大量培养替代稀缺野生资源。目前，红景天的毛状根诱导已取得成功，培养体系也已建立。徐洪伟等[27]利用发根农杆菌A4，R1601，ATCC15834菌株侵染高山红景天子叶和子叶节诱导获得毛状根，并对转化工程中侵染时间、菌体浓度、共培养时间等参数进行了优化，从而获得高产量的红景天苷。胡耀辉等[28]以双元表达载体pCAM-BIA1301为基础，用烟草根特异性启动子TobRB7和葡萄糖基转移酶基因UGTR分别取代双元表达载体中的CaMV35S启动子和GUS基因，从而获得了烟草根特异性启动子驱动葡萄糖基转移酶基因的表达载体，命名为pCA-Tob7：UGTR，并整合到了红景天发状根基因组中，为进一步研究特异性启动子对红景天苷合成的调控作用奠定了基础。尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶（UGT）和酪氨酸脱羧酶（TyDC）是红景天苷生物合成的2个关键酶，目前还没有酪氨酸脱羧酶基因转入红景天毛状根的报道，是一个值得研究的方向。

3、2、5 代谢工程技术 利用代谢工程技术生产红景天苷的前提是分离和鉴定红景天苷代谢途径中的功能基因，从而为代谢工程提供候选基因，以及明确代谢途径中的限速步骤，以便为代谢工程提供理想的作用靶点。近年来有不少研究者在与红景天苷合成有关基因的克隆与转化方面取得了良好的成果。李伟[29]于2003年成功克隆了大花红景天的苯丙氨酸解氨酶基因；马兰青[30]于2005年克隆了高山红景天的苯丙氨酸解氨酶基因（命名为PALc11）和UDP-葡萄糖基转移酶基因（命名为UGT1）。Gyrgy[31]于2006年克隆了一个编码玫瑰红景天酪氨酸脱羧酶的cDN段，根据这个基因在其根和叶中的表达分析，证实了酪氨酸脱羧酶在红景天苷生物合成中的重要作用。张继星[32]在2007年成功克隆了高山红景天的酪氨酸脱羧酶基因（命名为TyrDC1）和UDP-葡萄糖基转移酶基因（命名为UGT3）。于寒松等[33]在2008年成功克隆了高山红景天糖基转移酶基因家族里的3种基因（命名为UGTC1，UGTC2，UGTR），并利用CODEHOP方法克隆了高山红景天葡萄糖基转移酶基因cDN段。

4 展望

红景天苷药用功效显著，其来源备受世人关注。人工培育红景天苷高含量的红景天植物栽培品种所需的生境要求高，劳动成本大，很难满足日益增长的需求；红景天苷化学合成过程中掺入化学试剂，应用于食品行业受到很大限制；采用现代生物技术来提高红景天植株的红景天苷含量或另外开辟红景天苷的生物合成途径成为解决问题的有效方式。红景苷生物合成研究的不断深入，以及功能基因组学、代谢组学和生物信息学研究手段的不断丰富，使得准确阐明红景天苷整个生物合成途径的分子机制，并实现其代谢工程的生物合成已不再遥远。

总之，利用基因工程遗传改良红景天属植物，开展红景天苷代谢工程研究，进而利用细胞工程生产红景天苷具有很大优势。大量的细胞实验证实利用细胞工程手段生产红景天苷是可行的，目前需要解决的是工艺参数的优化，而越来越多的分子生物学证据显示红景天苷生物合成中起到限制性的因素是酪氨的积累，这可能存在反馈抑制。借鉴前人的研究思路，如获得酪氨反馈不敏感红景天突变株，可能会大大提高红景天苷的含量。因此，利用基因工程、细胞工程结合代谢工程是将来生产红景天苷的理想途径，红景天苷生物合成分子生物学研究、细胞工程研究和代谢工程研究在这方面将起到决定作用，为最终实现红景天苷商业化生产奠定基础。

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Research progress of alternative production approaches of salidroside

WU Xiu-wen， PENG Yu-shuai， WANG Ru-feng*

（School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract] Salidroside， one of the active components of Rhodiola plants， is a phenolic glycoside with significant biological activities、 The investigation and development of alternative production approaches of salidroside is of high academic and application values due to the limited resource of Rhodiola plants， and from which the low yield of salidroside、 This review summarized the research progress and perspective of the alternative production approaches of salidroside including both chemosynthetic and biosynthetic methods and pathways、

[Key words] salidroside； chemosynthesis； biosynthesis； review

doi：10.4268/cjcmm20132111