FG-FK506药物缓释系统对大鼠坐骨神经损伤修复作用的实验研究

【摘要】 目的 探讨在大鼠坐骨神经损伤后,局部应用纤维蛋白凝胶(FG)-他莫克司(FK506)药物缓释系统对神经再生的影响,为FK506的临床应用提供一种可行的给药方式。方法 取24只成年SD大鼠随机分为4组,切断左侧坐骨神经后随即进行显微吻合,其中实验组(B组)在吻合口周围应用FG-FK506药物缓释系统,另设3组对照(A、C、D组),分别作为空白对照组及全身应用FK506组、局部单纯应用FG组,术后观察各组大鼠的大体形态、步态、关节活动情况。术后12周测量坐骨神经诱发动作电位幅度和传导速度,计算小腿肌肉湿重恢复率。结果 术后各组大鼠均全部成活,术侧肢体活动受限,术侧负重区出现不同程度红肿及溃疡,肌肉萎缩,实验组大鼠肢体功能及肌肉萎缩恢复最快。术后12周实验组坐骨神经与周围组织无粘连,对照组与周围组织轻度粘连,远端神经略细。大鼠坐骨神经的复合肌肉动作电位波幅、运动神经传导速度及小腿三头肌湿重恢复率均高于对照组。结论 FG-FK506药物缓释系统在大鼠坐骨神经再生中起到明显促进作用,未引起全身及局部明显免疫抑制作用,是一种有效的给药方式。

【关键词】 药物缓释系统;神经损伤;修复;坐骨神经

Experimental study on the regeneration effect in the rat sciatic nerve transection model by FK506- FG drug delivery system

YAN Wen-zhu, QIN Shu-jian,LIU Xue-zheng,et al.

Department of Anatomy,Liao Ning medical college,Jin Zhou 121001,China

【Abstract】 Objective To observe the sciatic nerve regeneration effect by FK506- FG Drug Delivery System, and provide a feasible administration way in the clinic application for FK506.Methods 24 major SD rats were taken to arrange 4 groups in random, micro neuroanastomosis was performed on the sciatic nerve which had been cut off before .The test group’s ratswere bear FG-FK506 DDS around the anastomotic stoma. And then made 3antitheses groups (A.C.D group), A group as the blank control, C group’s rats were used FK506 by intraperitoneal injection last two weeks ,and used FG around the anastomotic stoma in D group .Observed the rats’ general status, pace, joint motion of each group after operation.12 weeks after the surgery , detected the sciatic nerve action potential of velocity of conduction, counted the wet weight recovery ratio of limb muscle ResultsAll the rats survived without infection after operation, the rats’ motion function were limited ,with reddish swelling on the rats heels and muscle atrophy of all the rats to varing degrees.the B group’s rats recovered their motion function and muscle atrophy faster than other groups. On the 12th week,there had no scar tissue on broken ends of B group ,but the nerve of other groups adhered lightly with circa-tissue. In group B, the recovery rate of gastronomies, the reborn nerve fiber number , the diameter, myelin sheath condition, the wet weight recovery ratio of limb muscle. Conclusion The FG-FK506 Drug Delivery System accelerate the nerve regeneration ratio obviously without immunosuppressant both in local and in whole body , providing a feasible administration way in the clinic application for FK506.

【Key words】 Drug delivery system; Nerve defect; Repair; Sciatic nerve

基金项目:辽宁省教育厅基金资助项目(项目编号:2006T063,2008422)

作者单位:121001辽宁医学院解剖学教研室

周围神经损伤是临床上常见的一种病损,但其手术治疗效果仍不理想,神经损伤后神经纤维再生速度缓慢是影响疗效的主要因素。国内外学者在神经生长因子(nerve grouth factor,NGF)、神经节苷酯(monosiaganglioside,GM1)等神经营养因子以及丙酸睾酮,钙通道阻滞剂等药物的研究中均取得了一定进展[1-7],它们在细胞体外培养模型中表现出良好的促进神经再生的能力,但大都处于实验阶段,临床实验进展缓慢,损伤后的神经纤维再生速度仍无明显提高。因此寻找促进神经生长、治疗神经损伤的有效药物仍是当前有关周围神经损伤中引人关注的课题之一。将纤维蛋白凝胶作为载体,复合他克莫司,形成FG-FK506 药物缓释系统,将其植入损伤的神经周围,达到使药物持续、缓慢释放的目的,能否对神经再生有促进作用,尚未见有关此方面的研究报道。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 注射用他克莫司(FK506)(香港腾泽药品(中国)有限公司)、天绣医用纤维蛋白胶(FG)(广州倍绣生物技术有限公司)。

本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文

1.2 方法

1.2.1 实验动物及分组 取健康SD大鼠24只,体重180~200 g,雌雄不限,动物由辽宁医学院实验动物中心提供。随机分为4组,每组6只。(表1)

表1

实验动物分组

组别数量(只)处置

A组(空白对照组)6空白对照

B组(FG-FK506 组)6吻合口局部应用 FG-FK506药物缓释系统

C组(FK506组)6术后腹腔注射FK506,0.5 mg/(kg•d),连续14 d

D组(FG组)6吻合口局部应用FG

1.2.2 大鼠坐骨神经损伤模型制作及处置方法

首先依照纤维蛋白凝胶说明书配置主体液及催化剂2组,分别置入产品自带双推器中,一组中两只注射器分别吸入0.5 ml注射用FK506,另一组中两只注射器分别吸入0.5 ml生理盐水,分别连好连接针座及无尖针头。全程无菌操作,放在手术台上备用[9,10]。3%戊巴比妥(30 mg/kg)腹腔注射麻醉,俯卧位,严格无菌操作,分离出左侧坐骨神经,于腓总神经分枝近端1 cm处切断,直接吻合,每个吻合口用8/0无创尼龙线外膜加束膜缝合法缝合4针,彻底止血后A组、C组直接逐层缝合切口,B组大鼠吻合神经吻合口周围注入预先混合好的FG-FK506,每只应用0.5 ml。D组大鼠神经吻合口周围注入FG,每只0.5 ml,注入凝胶后,5~10 s形成半透明乳白色薄膜,3~5 min后,FG完全凝固在神经吻合口周围,逐层关闭切口。所有动物术后连续3 d腹腔注射青毒素160 wu/kg,分笼标记,统一喂养。C组大鼠每日腹腔注射FK506 0.5 mg/(kg•d),连续14 d。

1.2.3 指标观察与检测

1.2.3.1 一般观察 术后连续观察各组大鼠局部伤口的愈合情况、足跟溃疡形成愈合时间、步态、关节活动情况,12周观察再生神经的大体形态。

1.2.3.2 神经电生理检测 术后12周各组大鼠用3%戊巴比妥钠腹腔麻醉后,俯卧位暴露左侧坐骨神经,利用肌电诱发电位仪检测神经功能,将接收电极置于小腿外侧中段腓骨长短肌肌腹中,刺激电极置于神经吻合口近端进行刺激,分别记录复合肌肉动作电位(Compound Muscle Action Potentials, CMAP)波幅、及运动神经传导速度(Motor Nerve Conductive Velocity, MNCV)。刺激参数为:1.0～2.0 mA,0.1 ms,1.0Hz.

1.2.3.3 肌肉湿重测定 术后第12周完整切取两侧小腿三头肌并标记,直至跟腱止点,用分析天平称湿重,将术(左)侧与各自对侧正常肌肉比较,得出恢复率(%)。

1.3 统计学方法 应用SPSS 15.0统计软件进行统计学处理,计量资料以(x±s)表示,组间均数进行单因素方差分析, P

2 结果

2.1 大体观察 术后各组大鼠均全部成活,伤口及全身均未出现明显感染,全部实验动物手术侧术后均出现膝部以下不能活动,不能展爪,行走时踝部着地,实验组大鼠6周左右、其余三组大鼠8周左右膝关节开始出现主动活动,12周时实验组大鼠足趾出现屈伸活动,其余三组大鼠足趾出现屈曲反应,踝关节活动仍明显受限。各组大鼠负重区皮肤均出现不同程度红肿及溃疡,实验组大鼠10周左右完全愈合,其余大鼠12周时基本愈合;各组大鼠术侧肌肉废用性萎缩,程度不一,实验组6周左右、其余三组8周左右开始恢复。

术后12周坐骨神经吻合口周围取材,见实验组及FG组局部无药物残留,实验组神经与周围组织无粘连,有完整外膜,再血管化较好;对照组、FG组神经与周围组织粘连,神经连续,断端粗大,表面可见微小血管网形成,远端神经略细。FK506组神经周围粘连程度介于以上两者之间,容易分离,远端神经略细,表面见血管网。

2.2 神经电生理检测 术后12周检测复合肌肉动作电位(Compound Muscle Action Potentials, CMAP)波幅、及运动神经传导速度(Motor Nerve Conductive Velocity, MNCV)。在吻合口近侧的正常神经上给予电刺激时,4组均在小腿外侧肌群上记录到诱发的运动神经传导电位。如表6所示FG-FK506组坐骨神经的动作电位及传导速度均高于其他三组,有显著统计学意义(P0.05,表2) 。

表2

术后12周MNCV和CMAP波幅的比较(x±s)

组别nMNCV(m/s)CMAP波幅

A组622.38士1.59*4.65士0.59*

B组631.93士1.826.72士0.74

C组624.04士1.77*4.53士1.13*

D组624.81士1.29*4.64士0.59*

注:与B组比较,* P0.05,无统计学意义

2.3 肌肉湿重测定 术后12周,小腿三头肌湿重恢复率经过单因素方差分析,按B、A、D、C顺序减少,B组与其他三组差异有显著统计学意义(P0.05.表3)。

表3

术后12周小腿三头肌湿重恢复率(%,n=6)

组别A组B组C组D组

小腿三头肌

湿重恢复率58.17±6.05*73.33±4.3753.67±3.50*54.83±3.25*

注:与B组比较,* P0.05,无统计学意义

3 讨论

本实验将FG作为载体,复合FK506,形成FG- FK506药物缓释系统,使药物持续、缓慢释放,使神经断端长时间维持有效药物浓度,起到明显促进神经再生的作用,且避免了免疫抑制等毒副作用的发生,是一种行之有效的给药方式。本实验中实验组大鼠FK506的总用量为9 mg/kg,张卫国等研究发现,给大鼠颈后皮下注射FK506 1 mg/(kg•d),大鼠出现食欲不振、活动少、抽搐等副作用,连续应用9 d后有大鼠因肺部感染死亡[8]。纤维蛋白凝胶是一种天然的细胞外基质,由动物体内提取,由2部分组成,试剂A主要含高浓度的纤维蛋白原、凝血因子ⅩⅢ,试剂B包含凝血酶及氯化钙,作为A的催化剂,当A与B混合后,凝血酶能水解纤维蛋白原,使之转化为纤维蛋白单体,单体自发聚合成不稳定的纤维蛋白多聚体,同时,在Ca2+催化下,凝酶能激活因子ⅩⅢ,从而催化肽链间的残基共价结合,形成稳定的纤维蛋白多聚体,在临床中已广泛应用,发挥其止血、封闭创面、粘合等作用。

本实验中所用FK506的剂量, 不但是根据国内外文献报道的FG作为缓释载体在机体内外的相关释放特性[9,10], 而且也参考了FK506在低剂量时能促进体内外神经再生的浓度范围而制定的,从实验结果来看,实验组大鼠神经再生速度明显优于对照组,且从全身症状及化验检查均未引起任何免疫副作用,而全身应用与实验组相当剂量FK506(总剂量为8 mg)的C组大鼠虽然无免疫抑制的副作用出现,但是也未出现明显的促进神经再生作用,这也间接证明将FG与FK506混合后避免了药物一次大量入血引起的免疫抑制等毒副作用的发生,同时延缓了药物的代谢速度,提高并维持了局部有效药物浓度,促进了神经再生。

本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文

参 考 文 献

[1] Obeski JK, Kerns JM, Safanda JF, et al. Function and structural effects of GM1 gangliosides treatment on peripheral nerve graft in the rat . Microsurgeiy,2001,21(3):108-115.

[2] Woolford TJ, Toeiumi DM. The enhancement of nerve regeneration using growth factors .J Long Term Elf Med Implants,1995, 5(1):19-26.

[3] Morrison RS, Kornblum HI, Leslie FM, et al. Trophic stimulation of cultured neurons from neonatal rat brain by epidermal growth factor.Science,1987,238:72-75.

[4] Alzheimer C,Werner S. Fibroblast growth factors and neuroprotection. Adv ExpMedBiol,2002,513:335-51.

[5] Frostick SP, Yin Q, Kemp GJ. Schwann cells, neurotrophic factors, and Peripheral nerve regeneration. Microsurgery,1998,18:397-405.

[6] BodjanacWG, Terzis JK, Liuzzi FJ. Effect of testosterone on a cross- facial nerve graftmode. Resconstr Microsurg, 2000, 16(6): 449.

[7] 张晓玲,唐金荣.钙通道阻滞剂对大鼠坐骨神经损伤后c-fos表达及神经功能的影响.临床神经病学杂志,2008,21(5):355-357.

[8] Udine E Cembalos D, Verde E. Bimodal dose-dependence of FK506 on the rate of axonal regeneration in mouse peripheral nerve.Muscle Nerve,2002,26: 348-355.

[9] 林博文,徐忠世,等.头孢唑啉钠-人纤维蛋白凝胶防治骨科感染的实验研究.中华创伤杂志,2005,21(3):192-195.

[10] 高秋明,刘兴炎,等. 纤维蛋白凝胶复合骨形态发生蛋白及庆大霉素缓释药物的制备及其体内动力学研究.西北国防医学杂志,2002,23(1):48-50.

本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文