椿皮提取物抗消化道肿瘤作用的相关研究

【摘要】 中药椿皮取自苦木科臭椿的树皮，臭椿的根皮、干树皮不仅有止泻、热除湿、杀虫、止血、收涩止带等功效，还具有消炎止痛、抗癌、抗人类疱疹病毒等功用。而且其对癌症的疗效极其明显，树皮中的苦木苦味素这一成分对宫颈癌、直肠癌、结肠癌的治疗效果显著，本文主要通过体外细胞实验验证了椿树皮的水提物、乙酸乙酯萃取物和石油醚萃取物体外抗肿瘤效果。

【关键词】 椿皮；抗肿瘤；作用；研究

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.03.580 文章编号：1004-7484（2014）-03-1647-02

中药椿皮取自苦木科臭椿的树皮，其根皮或干皮具有具有止泻、止血、收涩止带、清热燥湿、杀虫等功效。本文主要通过体外细胞实验验证了椿树皮的水提物、乙酸乙酯萃取物和石油醚萃取物体外抗肿瘤效果。

1 资料及方法

1.1 实验细胞株 人胃癌细胞株MGC-803、人肝癌细胞株Bel-7402、人结肠癌细胞株HT-29。以上细胞株均取自省中医院肿瘤科实验室。

1.2 主要试剂 RPMI-1840培养液（法国Biowest）；氯化钠注射液（石家庄四药）；胰蛋白酶粉（韩国Biosharp）；灭活小牛血清（北京方程生物）；EDTA（韩国Biosharp）；MTT粉剂（Sigma公司）；二甲基亚砜（DMSO）（分析纯上海谷研科技。

1.3 主要仪器设备 细胞培养超净台（江苏苏净集团）；全自动酶标仪（德国IFP）。

1.4 制备椿皮提取物 分别采用水提、石油醚以及乙酸乙酯两相萃取三种提取法对皮饮片进行提取，饮片用量l00g。方法：称取饮片100g，经麸炒后，加1000g水进行回流加热提取，共两次，每次1h，然后对所提取得到的药液进行减压浓缩，浓缩至40ml，留取5ml浓缩液。往剩下的35mL水提浓缩液中，缓慢添加95%乙醇使杂质沉降，最终醇含量控制在75%，静置过夜，抽滤，制得醇提取液90ml，留取10ml；余下的经蒸馏回收乙醇，依次使用石油醚，乙酸乙酯萃取，重复4次，所有萃取液减压蒸馏除去溶剂后，无水乙醇定容至100mL。

1.5 实验方法及操作

1.5.1 四甲基偶氮唑蓝（MTT）显色法验证 把Bel-7402、MGC-803、HT-29细胞分别接入含有小牛血清RPMI-1640培养液于37℃、35%CO2细胞培养箱中培养。当细胞液培养到对数增长期时取出用于实验。细胞培养液经0.25%胰酶+0.02%EDTA溶液消化后，7000r/min离心，弃上清，沉淀物用RPMI-1640培养液重新悬浮，使细胞浓度保持在5×103/ml左右，在往96孔培养板（经消毒灭菌）中每孔接种上述肿瘤细胞悬液100μl，37℃、35%CO2细胞培养箱中培养24h后轻轻吸去原培养液后，分别加入各200ul含上述三种提取液的完全培养液，每种提取液设置5个浓度梯度，每种3个复孔，空白组仅加完全培养液，实验组培养24h后更换培养液200μl。在37℃、35%CO2培养箱中培养36h后。吸去培养液，使用NS溶液洗板后每孔加入20μl5mg/mlMTT和100μl培养液，在放入37℃、35%CO2培养箱中4h后吸去所有培养液，之后每孔加入二甲基亚砜150μl，使用微型混合器振荡使MTT氧化产物晶体完全消失后，用酶标仪测定每孔悬液在490nm波长处吸光值（OD），参照抑制率公式计算出椿皮提取物对肿瘤细胞抑制率。该实验重复进行了三次。

1.5.2 有效药物提取方法的确定 用上述方法测出不同提取方法的椿皮处理后消化道细胞的OD值，比较椿皮各提取物对消化道肿瘤细胞体外增殖的抑制作用。

1.5.3 考察药物浓度、作用时间对抑制率的影响 考察本文所制得的提取物的浓度对消化道肿瘤细胞增殖的影响，把药物浓度设置为0.25mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml4个梯度。作用时间设置24h、48h两个时间段。

1.5.4 肿瘤细胞抑制率计算公式 增殖抑制率%=[（空白组OD值-实验组OD值）/空白组平均OD值]×100%

1.5.5 统计分析 统计分析采用SPSS15.0软件包对数据进行处理。P0.05为有统计学差异，P

2 结 果

2.1 试验表明48h后水提浓缩液和乙酸乙酯萃取液对MGC-803细胞增殖均有抑制性，但对药物浓度有一定要求。

2.2 椿皮乙酸乙酯萃取液对MGC-803细胞株增殖的抑制要求药物达到一定浓度：浓度在4mg/ml时，MGC-803细胞受到的抑制最强。抑制作用随着作用时间和药物浓度的增加而逐渐加强。

2.3 椿皮水提浓缩液及乙酸乙酯萃取液对Bel-7402增殖的抑制对药物浓度也有一定的要求：当在2mg/ml的浓度时，水提浓缩液对细胞增殖抑制不明显。在4mg/ml时，该细胞受到的抑制作用最强。抑制作用随着作用时间和药物浓度的增加而逐渐加强。

2.4 椿皮乙酸乙酯萃取液对HT-29增殖的抑制对药物浓度也有要求：当浓度≤0.25mg/ml时，对细胞增殖的抑制不明显。当浓度到达4mg/ml，对该细胞的增殖有着明显的抑制。抑制作用随着作用时间和药物浓度的增加而逐渐加强。

3 讨 论

本实验采用经典的MTT法，该方法灵敏度高，重复性好，操作简便、快速。系统地研究了椿皮水提浓缩液、酒精萃取液及乙酸乙酯萃取液对人胃癌细胞株MGC-803、人肝癌细胞株Bel-7402、人结肠癌细胞株HT-29的增殖抑制作用。实验表明椿皮乙酸乙酯萃取物对以上3种消化道肿瘤细胞的生长均有不同程度的抑制效果，且呈一定的时间和浓度依赖性，其中对人胃癌细胞MGC-803的抑制作用较强，对人结肠癌细胞HT-29的抑制作用较弱。本次研究还发现，椿皮乙酸乙酷萃取液对消化道肿瘤细胞株的体外增殖有抑制作用。

参考文献

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