杂种黄秋葵茎尖及试管苗培养的研究

摘 要：采用茎尖和试管苗培养的方法，以黄秋葵生长点为材料，进行了生长点的生长、分化芽的生根和试管苗的生根继代增殖培养，以及试管苗的移栽与定植的研究。结果表明：1/2MS+ZT 0.2 mg·L-1 +NAA 0.3 mg·L-1是生长点伸长生长的理想培养基；MS+6-BA 0.7 mg·L-1+AgNO30.8 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1是生长芽分化培养的理想培养基；1/3MS+ABT 0.6 mg·L-1+蔗糖10 g·L-1+IAA 0.4 mg·L-1是分化芽生根培养和生根继代增殖培养的理想培养基。试管苗移栽成活率为94.7%；定植成活率为97.4%；定植的试管苗保持了杂种黄秋葵的杂种优势。

关键词：黄秋葵；组织培养；试管苗

中图分类号：Ｓ６４１ 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2013.02.00４

Study on Propagation for Tender Buds and Tube Seedlings of Abelmoschus esculentus

XIA Hong-fei， LIU Lin-lin， LI Hui， WANG Xiao-xu， JIANG Chang-yang

（College of Life Sciences， Liaoning Normal University， Dalian， Liaoning 116029， China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Using the culture methods of shoot tip and tube seedlings， the Abelmoschus esculentus growing point for the material， the study was mainly on growth of growing points， differentiation of differentiation bud， rooting and subculturing of tube seedlings， and tube seedlings transplanting colonization. The results demonstrated that： 1/2MS + ZT 0.2 mg·L-1 + NAA 0.3 mg·L-1 was the optimum medium for the elongation growth of growing points； MS+6-BA 0.7 mg·L-1 + AgNO30. 8 mg·L-1 + NAA0.1 mg·L-1 was the suitable medium for differentiation cultivation of growth bud； 1/3MS + ABT 0.6 mg·L-1 + sucrose 10 g·L-1 + IAA 0.4 mg·L-1 was the optimum medium for differentiation， rooting and subculture of differentiation bud. The transplanting survival rate of tube seedlings was 94.7% and stable planting survival rate was 97.4%. Colonization of plantlets maintained the heterosis of Abelmoschus esculentus.

Key words： Abelmoschus esculentus； ｔissue culture； ｔube seedlings

黄秋葵（Abelmoschus esculentus）又称秋葵、补肾菜、阿华田、羊角豆等，属于锦葵科秋葵属一年生草本植物[1-2]。黄秋葵全株含黄酮和多种微量元素等有效成分，具有抗疲劳、提高免疫力和抗癌等功效，能治皮肤癌、烧伤、烫伤、胃炎和胃溃疡等疾病[3-4]。近年来果实的食用研究发现，黄秋葵的嫩果作为蔬菜食用，具有非常明显的补肾壮阳作用，由此引起人们的高度重视。

黄秋葵是异花授粉植物，偶尔会在实生苗植株中出现1株生长旺盛、结果多、具有明显杂种优势（以下简称杂种黄秋葵）的植株。但是，由于黄秋葵只能通过种子进行繁殖，因此无法使杂种黄秋葵的种质得到保存。为满足人们栽培的需要，使杂种黄秋葵的种质得到保存，2010年7月，再次发现杂种黄秋葵植株时，对其进行了生长点和试管苗培养的研究。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 材料培养及灭菌 7月中旬，将在大连郊区发现的杂种黄秋葵的植株顶端剪掉，采用顶端优势的措施，促进分枝，增加生长点的数量。待8月上旬生长出6个分支，并形成多个生长点后，将分枝采回实验室，除掉叶片后，将具有生长点的嫩茎放到广口瓶中，用无菌水洗涤3次后，再用0.01%的安利洗涤液洗涤5 min左右，接着用蒸馏水漂洗2次。转移到超净工作台上，用70%的乙醇灭菌10 s左右，立刻用无菌水洗涤3次，再用0.05%的HgCl3溶液振荡灭菌10 min，接着用无菌水振荡洗涤6次，即可获得具有生长点的嫩茎。

1.1.2 培养条件 以附加不同浓度、不同种类的细胞分裂素、生长素的MS或1/3MS为培养基。以MS为基本培养基附加蔗糖30 g·L-1，以1/3MS为基本培养基附加蔗糖10 g·L-1。培养基的pH值为6.0。培养过程在暗培养和光照培养两种条件下进行。光培养的光照度3 000 lx，12 h·d－１，培养温度为25 ℃。

1.2 方 法

1.2.1 生长点的伸长生长培养 在超净工作台上，将无菌嫩茎切成边长0.5 cm左右、具有1个生长点的茎段（下称茎段），接种到附加不同浓度的IBA、NAA或IAA的1/2MS+ZT 0.2 mg·L-1的培养基上，进行生长点伸长生长培养试验。试验重复2次，每个培养基接种10个具有生长点的茎段。

1.2.2 生长芽分化培养 把由生长点培养的生长芽剪成长约0.8 cm、具有2个生长点的茎段后，接种到以MS+6-BA 0.7 mg·L-1为基本培养基，附加不同浓度AgNO3与不同浓度NAA组合使用的培养基上，进行对生长芽分化培养的影响试验。分化培养的前20 d进行暗培养，之后进行光照培养。生长芽的分化培养试验每种培养基接种50个茎段，重复2次。

1.2.3 分化芽生根培养 将以上培养的分化芽从基部剪下，接种到1/3MS+ABT 2号（以下简称ABT）0.6 mg·L-1+蔗糖10 g·L-1为基本培养基，附加浓度分别为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mg·L-1的 IAA、IBA、NAA的培养基上，进行不同浓度生长素对分化芽生根的影响试验。不同浓度生长素对分化芽生根的影响试验重复2次，每种处理接种100个材料。

1.2.4 试管苗生根继代增殖培养 把生根试管苗剪成长约1.5 cm、至少有2个生长点的茎段后，接种到1/3MS+ABT 0.6 mg·L-1+蔗糖10 g·L－１+IAA 0.4 mg·L-1培养基上，进行试管苗的生根继代增殖培养试验。试验重复3次，每次继代增殖培养6代，每代接种培养400个茎段。

1.2.5 试管苗的移栽、定植 将生根继代增殖培养试管苗洗去根部的培养基，放到底部有一层约1 cm深干净水层的塑料盘中，在光照下炼苗3 d后，将其移栽到上层为6～10 cm厚干净河沙的温室苗床上或花盆中。移栽后要保持前12 d遮光、温度≥18 ℃、湿度约85%的环境条件。试验重复2次，移栽株数分别为200株。其中每次盆栽10株，苗床栽190株。并在每个花盆中同时定植上3株没有杂种优势的实生苗进行对照。

当苗床上移栽成活的试管苗长出约3片新叶时，定植到大连郊区农田上，并同时定植实生苗。在花盆中移栽成活的试管苗有的搬到实验室中。田间定植试验重复2次，每次定植175株，定植实生苗20株。

2 结果与分析

2.1 不同浓度生长素对生长点伸长生长培养的影响

培养到40 d时观察统计，结果见表1。在附加不同浓度IBA培养基上，生长点不能伸长生长；在附加不同浓度NAA和IAA培养基上，培养的生长点均能伸长生长；但在附加不同浓度IAA培养基上的伸长生长效果不及在附加不同浓度NAA的效果。在附加不同浓度NAA的培养基上生长点的伸长生长效果也有明显差异。其中在附加浓度为0.3 mg·L-1的培养基上，生长点的伸长生长效果最理想，不仅生长率最高，生长芽长度最长，而且生长芽外观长势最好。对培养过程的观察显示，在附加浓度为0.3 mg·L-1的培养基上，培养6 d可见有的生长点开始生长；培养到40 d时，绝大多数生长点都能培养成为外观上生长旺盛的生长芽。以上结果显示，1/2MS+ZT 0.2 mg·L-1 +NAA 0.3 mg·L-1这种培养基是杂种黄秋葵生长点伸长生长培养的理想培养基。

2.2 不同浓度的AgNO3与NAA组合使用对生长芽分化培养的影响

观察显示，在暗培养的条件下，培养到10 d左右时，在有的培养基上培养的生长芽上接触到培养基的生长点开始分化。随后，伴随着分化率的不断增加，先生长的芽基部又会分化出多个分化芽。培养到56 d时统计，结果见表2。在AgNO3 0.8 mg·L-1与浓度为NAA 0.1 mg·L-1组合使用的培养基上，生长芽分化的效果最理想，不仅分化率最高、平均分化的不定芽数最多，并且分化的分化芽长势旺盛。对分化培养过程的观察还表明，在AgNO3 0.8 mg·L-1与浓度为NAA 0.1 mg·L-1组合使用的培养基上，在暗培养期间形成的分化芽为淡黄色，转入到光照培养6 d左右，伴随着分化芽的不断增加，分化芽也变成了绿色。并且所有的分化芽的基部都连在一起，使培养的分化芽呈丛生状。2次重复试验的结果基本一致。以上结果证明：MS+6-BA 0.7 mg·L-1+AgNO3 0.8 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1 这种培养基是杂种黄秋葵生长芽分化培养的理想培养基。

2.3 不同浓度的生长素对分化芽生根培养的影响

培养到34 d时观察统计，综合2次重复试验结果证明，在附加浓度为0.4 mg·L-1 IAA的培养基上生根效果最好。在这一培养基上不仅平均生根率为94.3%、试管苗生根5.4条·株－１、叶片6.9个·株－１、茎粗0.23 cm、株高5.3 cm，而且外观上试管苗长势旺盛。结果说明，1/3MS+ABT 0.6 mg·L-1+蔗糖10 g·L-1+IAA 0.4 mg·L-1这种培养基是杂种黄秋葵分化芽生根培养的理想培养基。

2.4 试管苗生根继代增殖培养

试管苗继代增殖培养的结果显示：培养周期为30 d，所培养的试管苗平均生根率为96.8%、生根6.3条·株－１、株高5.1 cm，试管苗外观上长势旺盛，平均每个培养周期的繁殖系数为2.7。按照这个速度，1株试管苗1年可繁殖2.712（约为15万）株试管苗，除掉各种不利因素的影响，1年能保证繁殖出10万株试管苗。这种繁殖速度可满足对黄秋葵野生资源保护和实现栽培的需要。这也证明1/3MS+ABT 0.6 mg·L-1+蔗糖10 g·L-1+IAA 0.4 mg·L-1这种培养基也是杂种黄秋葵试管苗生根继代增殖培养的理想培养基。

2.5 试管苗的移栽、定植

移栽后30 d对苗床统计表明：第一次移栽成活177株，第二次183株，两次共成活360株，平均成活率为94.7%。

定植后40 d时统计显示：2次共成活341株，平均成活率为97.4%。观察表明，定植的具有杂种优势的试管苗容易成活、生长速度快，根系发达而洁白，外观上生长旺盛整齐。在花盆中和田间定植成活的杂种黄秋葵试管苗均在定植成活后84 d开花，113 d结出成熟的果实，并且植株生长旺盛，而在花盆中播种和田间播种的对照苗不仅几乎不开花结果，并且长势较弱。这说明本研究获得的试管苗仍具有杂种优势。

3 结论与讨论

采用茎尖和试管苗培养的方法，以黄秋葵生长点为材料，进行了生长点的生长、分化芽的生根和试管苗的生根继代增殖培养，以及试管苗的移栽与定植的研究。结果表明： 1/2MS+ZT 0.2 mg·L-1 +NAA 0.3 mg·L-1是杂种黄秋葵生长点伸长生长培养的理想培养基；MS+6-BA 0.7 mg·L-1+AgNO30.8 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1是杂种黄秋葵生长芽分化培养的理想培养基；1/3MS+ABT 0.6 mg·L-1+蔗糖10 g·L-1+IAA 0.4 mg·L-1是杂种黄秋葵分化芽生根培养和生根继代增殖培养的理想培养基。移栽后30 d平均成活率为94.7%。定植后40 d平均成活率为97.4%。

本研究通过茎尖和试管苗的培养，使具有杂种黄秋葵的种质得到了保存。这不仅证明采用茎尖和试管苗培养的方法能使黄秋葵自然杂种的杂种优势种质得到保存，而且这一技术也为其它栽培植物的非人工有利变异的种质保存提供新途径。

在本研究的试管苗继代增殖培养研究中，每个继代周期为30 d，而在分化芽的生根培养研究中的培养周期为34 d。同是生根培养，前者比后者缩短了4 d。出现这种现象的原因：一是前者使用材料为试管苗的茎段，后者使用的材料为分化芽。茎段的长势比分化芽旺盛，对环境的适应性强。二是分化芽是在分化培养基上形成的，而试管苗的茎段是在生根培养基上生长的。生根继代培养与生根培养使用的是相同的培养基。因此，后者在接种培养前，已经对培养基形成了适应性。

参考文献：

[1] 中国科学院北京植物所.中国高等植物图鉴（第二册）[M].北京：科学出版社，1972：814.

[2] 中国科学院中国植物志编撰委员会.中国植物志 （第四十九卷：第二册）[M].北京：科学出版社，1984：56-58.

[3] 南京中医药大学.中医药大辞典（上册） [M].上海：上海科学技术出版社，2006：528-529.

[4] 吴燕春，谢金群.黄秋葵的研究进展[J].中医药学刊，2005，23（10）：1898-1899.