时间：2022-07-19 05:50:30
[摘要] 目的 研究羧甲基壳聚糖对变形链球菌表面疏水性及黏附能力的影响。 方法 采用微生物黏着碳氢化合物法（MATH）测定不同浓度的羧甲基壳聚糖对变形链球菌表面疏水性的影响；并采用不同浓度的羧甲基壳聚糖与变形链球菌共同培养计算羧甲基壳聚糖对变形链球菌的黏附率的影响。 结果 不同分子量的羧甲基壳聚糖浓度为0.16 g/L时可降低变形链球菌表面的疏水性，并抑制变形链球菌在光滑玻面的黏附。 结论 羧甲基壳聚糖可以有效抑制变形链球菌的疏水性及黏附能力。
[关键词] 变形链球菌；羧甲基壳聚糖；疏水性；黏附力
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）07（c）-0129-03
变形链球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）是公认的口腔主要致龋菌[1]，具有高度黏附于牙面的能力，变链菌在牙面上黏附和定植是变链菌致龋的始动因子[2]其黏附过程经历两个阶段后形成菌斑生物膜。第一阶段变链菌表面蛋白与获得性膜中宿主因子之间相互作用形成初始黏附，即非蔗糖依赖性黏附。第二阶段变链菌的葡糖基转移酶（glueosyltransferase，GTFs）利用蔗糖合成水不溶性葡聚糖来介导该菌的蔗糖依赖性黏附、集聚。变链菌通过黏附定居于牙面，形成致龋性微生态环境牙菌斑，利用糖产酸，导致牙齿脱矿，产生龋病[3]。细菌表面疏水性（cell surface hydrophobicity，CSH）是细菌非特异性黏附的重要部分，研究表明，细菌表面疏水性在细菌对牙面及口腔上皮细胞的初始黏附中起着重要作用，表面疏水性越强的细菌黏附力越强[4]。目前寻找安全有效的防龋物质是龋病防治研究的重点。羧甲基壳聚糖对诸多口腔细菌均有一定的抑制作用[5]，并具有良好的生物相容性和可降解性，可形成凝胶或膜状结构，尤其适用于口腔。目前对其在防龋方面的研究主要集中在抑菌方面，而对其防龋机制的研究报道较少。
本研究采用微生物黏着碳氢化合物法（microbial adhesion to hydrocarbons，MATH）[6]，测定不同浓度的羧甲基壳聚糖对变形链球菌表面疏水性的影响及在玻壁表面的黏附作用，探讨其影响变形链球菌黏附的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
3种羧甲基壳聚糖，平均相对分子质量（MW）分别为5500、10 000、12 000，脱乙酰度（D.D）均为90.6%，由青岛海汇生物工程有限公司提供；TPY培养基，由北京陆桥技术有限公司提供。十六烷（沃凯），购自国药集团化学试剂有限公司（上海）。BHI培养基：OXOID LTD，Basingstoke，Hampshire，England。实验菌株变形链球菌Streptococcus mutans，S.mutans ATCC 25175，菌株由四川大学口腔生物医学工程教育部重点实验室提供。
1.2 实验方法
1.2.1 菌液调整 将变形链球菌ATCC25175冻干菌株复苏并接种于BHI固体培养基中，在37℃（80%N2、10%H2、10%CO2）厌氧培养48 h，经鉴定后，转移到含2%蔗糖的BHI液体培养基中，于37℃（80%N2、10%H2、10%CO2）条件下厌氧箱培养24 h。以2500 r/min离心15 min（离心半径13.5 cm），收集细菌，PUM缓冲液洗菌3次，每次3 mL。用PUM缓冲液作为空白对照，将紫外可见分光光度计调零，用PUM缓冲液调在660 nm波长处吸光度A = 0.5的菌悬液。
1.2.2 实验分组 实验分为空白对照组及实验组。空白对照组的菌体用PUM缓冲液处理（不含羧甲基壳聚糖溶液）3 mL；实验组分别为含不同分子质量不同浓度的羧甲基壳聚糖的BHI培养基3 mL，浓度分别为：5，2.5，1.25，0.64， 0.32，0.16 g/L，共7组。以上实验组和对照组每组4个平行管，共计84管。
1.2.3 疏水性测定 采用微生物黏着碳氢化合物[6]（microbial adhesion to hydrocarbons，MATH）测定不同浓度的羧甲基壳聚糖对变形链球菌表面疏水性的影响。调整菌悬液的吸光度A = 0.5取3 mL加入羧甲基壳聚糖溶液的试管中，混和均匀，再将其放置在水浴箱中，调整水浴箱的温度为37℃孵育15 min，取3 mL，加入400 μL十六烷，剧烈震荡60 s，使各个试管充分混和均匀。然后再静置15 min，使试管中的羧甲基壳聚糖溶液分为上下两层，其上层为油层，下层是水层，取油层进行革兰染色，显微镜下观察细菌；保留水层，用紫外可见分光光度计在660 nm波长处测定各个试管的吸光度A值，每管分别测3次，记录平均值。细菌表面疏水率=（初始A660nm-加十六烷后A660nm）/初始A660nm×100%。
1.2.4 黏附作用的测定 采用Hattori等[2-7]的研究方法测定其对变形链球菌的黏附抑制作用。取84个10 mL玻璃试管，设每组4个平行管，分别加入以上备好的菌液0.1 mL，BHI液体培养基2.1 mL和50%蔗糖-0.5 mol/L磷酸盐缓冲液0.25 mL，再分别向各个试管中加入实验组（分别为含不同分子量不同浓度的羧甲基壳聚糖的BHI培养基3 mL）和对照组（不含羧甲基壳聚糖溶液）溶液0.05 mL，混和均匀，将各个试管与水平面斜行呈300°角放置，37℃（80%N2、10%H2、10%CO2）的条件下放置于厌氧箱中培养18 h。然后轻轻移去试管中的溶液，将黏附到试管壁的细菌用蒸馏水洗脱，每次3 mL，共计3次，然后以3500 r/min离心15 min（离心半径13.5 cm），收集细菌，再将其置于3 mL蒸馏水中，混匀。用波长为550 nm的紫外可见分光光度计测定A550nm，计算黏附抑制率。羧甲基壳聚糖对变形链球菌的黏附抑制的影响使用黏附抑制率表示。黏附抑制率=（对照组A550nm-实验组A550nm）/对照组A550nm×100%
1.3 统计学方法
采用统计软件SPSS 17.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，各样本组间均数之间的比较采用SNK检验。以P
2 结果
2.1 羧甲基壳聚糖对变形链球菌ATCC 25175表面疏水性的影响
结果见表1，不同分子质量羧甲基壳聚糖随着其浓度的增加其疏水率逐渐降低。经统计学分析：同一分子质量，浓度不同各组羧甲基壳聚糖与对照组之间差异均有统计学意义（P < 0.05）。组间两两比较结果显示：分子量为5500的羧甲基壳聚糖浓度为1.25、2.5、5.0 g/L组间差异有统计学意义（P < 0.05）；0.64、0.32、0.16 g/L时，组间差异无统计学意义（P > 0.05）；分子量为10 000的羧甲基壳聚糖浓度为0.64、1.25、2.5、5.0 g/L组间差异有统计学意义（P < 0.05）；0.32 g/L与0.16 g/L时组间差异无统计学意义（P > 0.05）；分子量为12 000的羧甲基壳聚糖，5 g/L与2.5 g/L，0.64 g/L、0.32 g/L、0.16 g/L之间组间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。
2.2 羧甲基壳聚糖对变形链球菌培养后菌液吸光度值的影响
结果见表2，随着羧甲基壳聚糖溶液浓度的升高，其黏附吸光度值逐渐降低。经统计学检验，分子质量相同，浓度不同的各实验组与对照组之间差异均有统计学意义（P < 0.05）。组间两两比较结果显示：当分子量为5500及10 000时，0.32 g/L与0.16g/L两浓度组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）；当分子量为12 000时，0.64、0.32、0.16 g/L浓度组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。
2.3 羧甲基壳聚糖对变形链球菌黏附抑制的影响
结果见表3，不同分子质量羧甲基壳聚糖随着其浓度的增加其黏附抑制率也随之降低。经统计学分析，分子质量相同，浓度不同的各组黏附抑制值总体均数间具有显著性差异（P < 0.05）。两两比较结果显示：分子质量为5500及10 000时，0.32 g/L与0.16 g/L两个浓度组间比较无统计学差异。分子量为12000时，0.64 g/L、0.32 g/L与0.16 g/L浓度组间比较无统计学差异（P > 0.05），其他各浓度组间黏附抑制值均有显著性差异（P < 0.05）。
3 讨论
3.1 壳聚糖/羧甲基壳聚糖对变形链球菌的疏水性作用的影响
目前研究认为，蔗糖非依赖性黏附主要是通过疏水作用、钙桥静电、氢键等非特异性黏附和细菌表面粘结素与获得性膜受体之间的特异性黏附。疏水性是指非极性溶液在极性水中所呈现的一种不稳定状态，并由此引发的一系列热能和分子重新分布及排列的变化[8]。CSH被认为是影响细菌一宿主反应的因素之一，其强弱与蔗糖非依赖性黏附密切相关[9]。近期的研究发现，疏水性的强弱与细菌表面蛋白、菌毛、脂磷壁酸、荚膜等结构有关。细菌表面的疏水蛋白与获得性膜中的疏水基团结合，表面疏水蛋白愈多其疏水性愈强，细菌黏附力也愈强[10]。
MATH是根据细菌在各种碳氢化合物中经过简短期的混合，下层水相吸收能力减少，从而导致细菌对碳氢化合物黏附的程度不同，通过测定水相的吸光度，可确定细菌表面疏水性的大小[11]。本实验即采用该方法研究羧甲基壳聚糖对变形链球菌疏水性的影响。结果表明：不同分子量的羧甲基壳聚糖溶液，浓度为0.16 g/L时作用于变形链球菌细胞表面，其表面疏水性明显降低，与空白对照组之间有显著性差异。本实验表明：浓度为0.16 g/L羧甲基壳聚糖溶液可以通过表面疏水性明显降低来抑制变形链球菌的黏附作用。它的作用机制是疏水作用、钙桥静电、氢键等非特异性黏附和细菌表面粘结素与获得性膜受体之间的特异性黏附，还是通过其他方式，需要进一步进行机制的研究。
3.2 壳聚糖/羧甲基壳聚糖对变形链球菌的黏附作用的影响
黏附在牙齿龋病发生中起重要作用，而变形链球菌对牙面有高度的黏附作用。壳聚糖及其衍生物对变形链球菌黏附抑制作用已有少量报道。
Tarsi等[12]报道低分子量壳聚糖能选择性阻止变形链球菌在羟基磷灰石表面的黏附及促进已黏附的变形链球菌的解脱。Virga等[13]研究证实，高分子壳聚糖当浓度为0.5%时即可对变形链球菌产生特异性的解脱黏附作用。有研究指出[10]，壳聚糖可抑制变形链球菌对毛细管的黏附，并促进附着于黏附板上的变形链球菌脱落，0.5%浓度的壳聚糖作用强于0.25%。
本研究与上述报道相似，结果表明，不同分子量的羧甲基壳聚糖可降低变形链球菌表面的疏水性，并抑制变形链球菌在光滑玻壁表面的黏附能力；当浓度为0.16 g/L时作用于变形链球菌培养后，其菌液吸光度值与对照组相比具有显著性差异。羧甲基壳聚糖能够有效降低口腔内变形链球菌的黏附，从而减少其在菌斑中的数量，在临床上可以通过羧甲基壳聚糖的这一特性达到防治龋病的目的。但其作用机制复杂，是否存在对黏附作用抑制的另外机制，既蔗糖依赖性黏附有抑制作用，还需要进一步深入研究。
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（收稿日期：2013-04-18 本文编辑：卫 轲）