光滑假丝酵母菌耐药基因CDR1、CDR2、SNQ2表达的研究

【摘要】目的：探讨光滑假丝酵母菌耐三唑类抗真菌药物临床株耐药基因表达情况。方法：34株复发性外阴阴道假丝酵母菌病的临床分离株，通过26S rDNA D1／D2区分子鉴定为光滑假丝酵母菌，应用法国生物梅里埃酵母菌药敏试剂盒ATBTM FUNGUs3，进行体外药物敏感性试验。实时荧光定量PCR方法检测34株菌株耐药基因CDR1、CDR2、SNQ2表达量。结果：34株光滑假丝酵母菌菌中，有2株为敏感株，2株对ITR剂量依赖敏感，30株为耐药株，且呈现交叉耐药现象。对氟康唑(FCA)、伊曲康唑(ITR)、伏立康唑(VRC)抗真菌药物的耐药率分别为26.32％、86.84％、34.21％。耐药株CDR1、SNQ2基因表达明显高于敏感株(P0.05)。结论：光滑假丝酵母菌对三唑类药物MIC值高，其药物敏感性低与耐药基因CDR1、SNQ2的过度表达有关。

【关键词】光滑假丝酵母菌；耐药性；基因表达；CDR1 CDR2 SNQ2

近年来，白色假丝酵母菌在临床的分离率有所下降，非白色假丝酵母菌的分离率上升趋势明显，其中由光滑假丝酵母菌引起的感染增加，因其引起感染的治疗相对困难，对唑类药物耐药和具有高死亡率而被关注。光滑假丝酵母菌成为医院黏膜和血流感染的重要病原菌，也是外阴阴道假丝酵母菌病(vulvovaginalcandidiasis，VVC)的常见病原真菌。关于复发性外阴阴道假丝酵母菌病菌种的药敏试验和基因分型的研究颇多，耐药基因表达和机制的研究报道却少见。本研究通过检测分离于复发性外阴阴道假丝酵母菌病的光滑假丝酵母菌耐药基因CDR1、CDR2和SNQ2的表达量，探讨其耐药性与基因表达的关系。

1　材料和方法

1.1　材料

1.1.1　菌株　来源于2009年3月～2010年9月间93例患复发性外阴阴道假丝酵母菌病患者，通过对其核糖体基因26S rDNA D1／D2区进行分子鉴定为光滑假丝酵母菌的34株样本。

1.1.2　主要试剂　YEPD培养基、TAE、琼脂糖等生化试剂购置于上海生工公司；酵母菌药敏试剂盒ATB FUNGUS3为法国生物梅里埃公司；总RNA提取、去除基因组DNA及反转录反应、EASY Dilution、DL－2000、实时定量PCR试剂(D9082、DRR047、D9160、D501、DRR039)等均购置于大连TaKaLa公司。

1.1.3　仪器设备　德国HETFICH Universal32R离心机、Biometra Standard Power PackP25电泳仪、美国BECKMAN DLL530蛋白核酸分析仪、法国VL BIO—PRIUT凝胶成像系统、英国HYBAID EXPRE8梯度PCR仪以及美国AB17500实时定量PCR仪等。

1.2　方法

1.2.1　药物敏感性试验　活化保存的菌株接种于沙堡弱培养基，35℃／48±2h，挑取单个菌落，用0.85％API氯化钠培养悬液制成2个麦氏单位的菌悬液。按药敏试剂盒ATBT FUNGUS3的说明进行操作。对于两性霉素B(AMB)，MIC≥2mg／1判断为耐药。氟胞嘧啶(5FC)、氟康唑(FCA)、伊曲康唑(ITR)、伏立康唑(VRC)根据CLSI／NCCLS推荐的假丝酵母菌属(2，3)的分界点，肉眼判读结果。将敏感株作为S组，剂量依赖敏感株为SDD组，耐药株为R组。

1.2.2　总RNA提取　活化保存的菌株，接种于5mlYEPD液体培养基，35℃过夜培养，收集OD600—3.O的菌液至1.5ml Microtube中，按照试剂盒提供的标准操作方法提取总RNA，溶于RNase free dH2O中。配制1％琼脂糖凝胶，1×TAE、100V30min电泳，于凝胶成像系统观察电泳条带，证实提取的总RNA。另取RNA溶液于紫外分光光度仪测定260nm、280nmOD值，计算浓度和OD260／OD2so比值，使其在1.8—2.2，稀释浓度为200ng／ul，－20℃保存备用。

1.2.3　去除基因组DNA与RT反应　基因组DNA的除去反应体系如下：5×gDNA Eraser Buffer2ul，gDNA Eraser 1ul，Total RNA 5ul，RNase free dH2O2ul，于PCR仪42℃2min。RT反应体系为：5×Prime—Script Buffer2(for Real Time)4ul，PrimeScript RT En—zyme Mix I lul，RT Primer Mix 1ul，RNase free dH2O4ul，去除基因组DNA的反应液10ul。于PCR仪37℃15min，85℃ 5sec。

1.2.4　引物的合成

引物参照文献由大连TaKaLa公司合成，方向为5＇3’。

CDR1 a : TAGCACATCAATACACGAACGTCDR1 b : AGAGTGAACATIAAGGATGCCATGCDR1 pr: 6FAM - TGCTGCTGCTICTGCCACCTGGTF -TAMRA CDR2a: GTGCTTIATGAAGGCTACCAGATI

CDR1b : TCTIAGGACAGAAGTAACCCATCTCDR2pr: 6FAM - TACCTFTGCGTGCTGGGCGTCACC -TAMRA　SNQ2a: ACCATGTGTICTGAATCAATCAATSNQ2b : TCGACATCATITACAATACCAGAAA SNQ2pr:6FAM - AACTAATCGCCGCAGGTIGTGACA - TAMRA

参比基因：为管家基因 URA3 URAa: GAAAAC-CAATCTTGTGCTTCTCT URAb: CATGAGTCTTAAG-CAAGCAAATGT URApr: Texas Red - ACGTCACCAC-CACCAGCGAATIGT - BHQ2