地中海贫血实验诊断进展

摘要：在人类遗传疾病中，地中海贫血较为常见，它是一种隐性遗传病。地中海贫血作为一种溶血性贫血症，具有较大的地域性差异，我国南方为地中海贫血的多发地区，其具有胎儿死亡率高、发病率高的特点，临床上目前还没研究出彻底治愈地中海贫血的方法。所以选择合理的实验方法诊断地中海贫血，是预防重型地中海贫血的一项有效措施，在产前诊断中，可诊断出重型地贫胎儿，预防患儿出生。本文主要对地中海贫血的各种实验诊断方法进行了综述。

关键词：地中海贫血 α珠蛋白基因 β珠蛋白基因 重型地中海贫血

Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2013.08.069

【中图分类号】R-0 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2013）08-0073-02

地中海贫血（简称地贫）是一组先天性溶血性疾病，也是最为常见的一种单基因遗传疾病。地中海贫血是由于珠蛋白基因发生突变或缺失，使一种或多种珠蛋白肽链发生合成障碍，改变血红蛋白结构，缩短红细胞寿命，从而发生慢性溶血[1]。按照受累珠蛋白肽链的不同，将地中海贫血分为α、β、γ、δ、δβ等类型，其中最为常见的是α地贫和β地贫，其产生的危害也是最大的。α地中海贫血，是指α珠蛋白基因发生突变或缺失，所造成的α珠蛋白肽链合成障碍[2]。β地中海贫血，是指β珠蛋白基因发生突变，所造成的β珠蛋白肽链合成不足或缺失[3]。

1 地贫的分子基础

在人体中，由α2β2四聚体所构成的血红蛋白（HbA）决定着红细胞呼吸，血液中有98.5%的O2都由HbA进行运输[3]。若匹配的两条α肽链、两条β肽链中有任何一条发生了合成障碍，就会引起地中海贫血，使红细胞膜骨架发生异常，珠蛋白链发生沉淀，发生无效性骨髓红细胞生成现象，导致红细胞脆性降低、异形性增加、僵硬、变小，发生以脾溶血、骨髓溶血为主的溶血性贫血[4]。

α珠蛋白基因发生突变或缺失，β珠蛋白水平升高，会降低α2δ2水平和Hb-A2水平，游离的γ肽链、β肽链通过自身的聚合作用，形成Hb Bart（γ4聚体）、HbH（β4聚体）。β4聚体不稳定，且容易发生自身氧化作用，使红细胞膜脂质发生过氧化损伤，对红细胞内霉的活性产生抑制作用[5]。γ4聚体具有较高的氧亲和力，对于低氧分压组织，无法释放氧，从而易使组织发生缺氧现象。

2 地贫的筛查方法

在医学水平、医疗技术的不断发展下，地贫的临床治疗已获得了很大的进步，然而重症地贫仍然较难治愈。在地贫试验诊断中，筛查法是较为常用的一种方法，应用筛查法对孕妇进行产前诊断，能有效预防重症地贫的发生。地贫筛查法具有经济负担小、操作简便的优点，常见筛查手段包括血红蛋白分析和血液常规检查两类，具体检查项目包括血细胞计数、血红蛋白分析、红细胞形态学及渗透脆性检测。

2.1 血细胞计数。地贫筛查法中，会应用血细胞计数仪测定血液中的WBC（白细胞数）、血小板参数和RBC（红细胞数）。地贫的一个主要症状就是红细胞色素含量降低、体积变小，故MCV（红细胞平均体积）和MCH（红细胞血红蛋白含量）在地贫筛查中发挥着重要作用。当MCH

2.2 血红蛋白分析。定量、定性分析血红蛋白，是临床确诊地贫的可靠方法。血红蛋白分析可采用毛细管电泳、Hb电泳、血红蛋白琼脂糖电泳等方法。其中，毛细管电泳是以毛细管作为Hb的分离通道，Hb在电场的作用力下，会发生定向移动，根据其速度差别来实现分离，该方法具有试剂量少、消耗样品少、分辨率高、灵敏度好、重现性高、简便快捷等优点，在临床上已得到了广泛的应用[7]；Hb电泳法的作用机理为：Hb等电点均

2.3 红细胞渗透脆性检测。红细胞渗透脆性检测的目的是检验红细胞在不同渗透压下的抵抗力。通过红细胞渗透脆性检测试验，可找到红细胞溶血的界限值，这一界限值是由红细胞的体积与表面积之比来决定的。由于地贫患者的红细胞膜发生了代谢、生化和形态异常，所以其红细胞脆性会比正常人低，其在0.36%的氯化钠溶液中溶解度会降低[8]。同时，缺铁性贫血检测指标也呈阳性。最近几年，红细胞脆性检测和MCV在国内外地贫筛查检测中得到广泛的应用。

2.4 红细胞形态学检查。在涂片上进行瑞氏染色，观察红细胞形态、体积的变化情况。在地贫诊断中，红细胞形态学变化也是一个重要的判定依据，根据患者贫血程度的不同，红细胞会呈现各种异常形态、大小不均、靶形红细胞、点彩红细胞等。病情越严重，红细胞的形态学变化越明显。

3 地贫的基因诊断法

地贫的发生与珠蛋白合成被阻断有着密切联系，大多数的地贫患者都是因为缺失珠蛋白合成所引起的。地贫的发生不但与DNA构造有关，还与基因翻译、转录过程紧密相关，故采用基因检测能更准确地诊断、预防地贫。基因诊断（分子诊断），是通过分析人体某一特定DNA或mRNA（转录物），来诊断遗传病的一种技术。在我国，最早的地贫基因诊断技术是DNA点杂交，后来相继经历了限制性内切酶酶谱分析、RFLP（限制性内切片段长度多态性）连锁分析、ASO（寡核苷酸）探针杂交、PCR（聚合链酶反应）以及芯片技术几个发展阶段[8]。尤其是PCR及其相关技术已成为了地贫临床诊断中的普遍方法。

3.1 DNA点杂交。该方法是最早应用于地贫基因诊断的方法，它将基因作为靶分子，进行基因与基因间的杂交。基因杂交后采用电泳法对待测基因进行分离，并将分离后的基因进行转运，使之与支持物结合，再利用标记探针进行检测。该方法诊断效率低下。在上世纪90年代初，有学者在地贫诊断中初次运用了反向杂交技术，该技术的运用使地贫诊断效率大为提高。通过改良，反向点杂交技术可以利用不同类型地贫的已知突变基因对，在末端转移酶的作用下，使其扩增为多聚尾巴，并固定在膜上，实现靶序列的扩增、杂交。与一次杂交方法相比，反向杂交能在待测样本中获取多种突变序列，使检测时间大大缩短，诊断效率大为提升。在反向杂交技术下进行二次杂交，还可判断出地贫类型，辨别不同突变类型的等位基因对、杂合子、纯合子等，该技术是我国近年来在地贫实验诊断中应用较多的方法[9]。

3.2 RFLP连锁分析。RFLP连锁分析的原理：基因的限制性内切酶具有识别、切割核苷酸序列的功能，通过切割核苷酸序列，可获得DN段。碱基突变使限制性内切酶的切位点发生丢失或增多，改变DN段大小。在限制性内切酶的水解作用下，突变基因电泳条带的大小、数量均会改变，分析这些改变情况就能判定基因是否发生了突变。该方法的缺点在于操作繁琐，且无法检测出突变基因类型。

3.3 ASO探针杂交技术。ASO探针杂交的技术原理为：利用引物使珠蛋白基因扩增，并合成与突变序列、正常序列互补的ASO探针。在尼龙膜上点上聚合链酶反应扩增产物，将其与突变ASO探针、正常序列分别进行杂交，一定条件下将未完全互补的探针完全洗脱，然后通过放射自显影技术查看杂交结果。该技术具有灵敏、快速的优点，但其对DNA数量、纯度的要求均较高，目前在β地贫基因诊断中的应用较多。

3.4 PCR技术。聚合链酶反应，是在体外环境中，应用DNA聚合酶催化成对引物的DNA特异性片段，进行基因合成，以实现体外扩增的一种技术。目前在α地贫的基因诊断中较多地应用到了PCR技术，尤其是多重PCR技术（mPCR）的应用，mPCR技术的特点在于一个聚合链酶反应体系中有四对特异引物，其根据各突变位点的扩增情况来加以判断。mPCR技术可检测出α-SEA（东南亚型珠蛋白基因缺失）、―α3.7（右缺失）、―α4.2（左缺失）。mPCR技术不仅能辨别α地贫的类别，还能进行基因分型。在产前诊断、分子筛查中采用单管mPCR技术，能快速、准确地检测出―α4.2、―α3.7、―SEA型α地贫。

3.5 PCR、斑点杂交结合技术。PCR、斑点杂交结合技术在β地贫的分型、诊断中得到了初次运用，应用结果表明，该技术的准确性、可靠性均较高，并且样品耗用量少，经济性高。在应用该方法进行地贫基因诊断时，要对待查基因逐个进行筛查以明确发生了何种突变，故该方法需要较长时间，同时还应当具备3个条件：一是要有已知突变基因，将其作为模板，利用PCR技术扩展突变序列、正常序列片段，把放在中心位置的突变基因标记为探针；二是需要挑选出合适的引物；三是要控制好杂交条件，确保待测碱基与探针之间没有配错情况发生，以免出现杂交失败。

4 总结

综上所述，地中海贫血的异质性、地域差异性较大，这就增加了临床诊断及处理的难度。为实现优生优育的目标，产前通过基因诊断、系统筛查，实施对无症状携带人群的监控，是预防重型地中海贫血的一项有效措施。若夫妻双方是同型的地贫患者，妊娠时就会有25%的几率发生重型地贫儿，所以应当对常见地贫基因型进行准确、及时的产前诊断，综合应用基因诊断法和筛查法，以提高诊断准确性，尽早发现重型地贫患儿，及时采取相应措施。目前，临床对于地中海贫血的诊断，多采用多重PCR技术和PCR结合反向点杂交技术，其能对常见的α和β地中海贫血进行准确、快速的诊断。在产前诊断中，可诊断出重型地贫胎儿，预防患儿出生。

参考文献

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