雄激素受体、磷酸化蛋白激酶B在三阴性乳腺癌中的表达及意义

[摘要] 目的 探讨雄激素受体（AR）、磷酸化蛋白激酶B（P-PKB）在三阴性乳腺癌中的表达及意义。 方法 收集2012年3月～2015年3月惠州市中心人民医院收治的乳腺癌患者115例，其中三阴性乳腺癌54例，非三阴性乳腺癌61例。采用免疫组化S-P法检测AR、P-PKB表达。比较三阴性乳腺癌和非三阴性乳腺癌AR、P-PKB表达阳性率，分析三阴性乳腺癌组织中AR和P-PKB表达与临床病理参数的关系。 结果 三阴性乳腺癌AR阳性表达率明显低于非三阴性乳腺癌（P < 0.05）；三阴性乳腺癌P-PKB阳性表达率明显高于非三阴性乳腺癌（P < 0.05）；三阴性乳腺癌组织中AR的表达与临床分期和淋巴结转移情况呈显著负相关（r = -0.295、-0.311，P < 0.05）；三阴性乳腺癌组织中P-PKB的表达与临床分期和淋巴结转移情况呈显著正相关（r = 0.332、0.329，P < 0.05）。 结论 AR、P-PKB在三阴性乳腺癌的表达具有重要的意义，可以作为预后的重要指标，并有望成为未来治疗三阴性乳腺癌的新靶点。

[关键词] 雄激素受体；磷酸化蛋白激酶B；三阴性乳腺癌；表达

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）03（b）-0124-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of androgen receptor （AR） and phosphorylated protein kinase B （P-PKB） in triple negative breast cancer. Methods From March 2012 to March 2015， in Central People's Hospital of Huizhou City， 115 patients with breast cancer were selected， among them， 54 cases were triple negative breast cancer， 61 cases were non-triple negative breast cancer. The expression of AR and P-PKB was detected by immunohistochemistry S-P method. The expression of AR， P-PKB， and AR in triple negative breast cancer and triple negative breast cancer tissues were compared， and the relationship between the expression of P-PKB and the clinicopathological parameters were analyzed. Results AR positive expression rate of triple negative breast cancer was significantly lower than non-triple negative breast cancer （P < 0.05）； P-PKB positive expression rate of triple negative breast cancer was significantly higher than non triple negative breast cancer （P < 0.05）； AR expression of triple negative breast cancer tissues had a significantly negative correlation with clinical stage and lymph node metastasis（r = -0.295， -0.311， P < 0.05）； P-PKB expression of triple negative breast cancer tissues had a significantly positive correlation with clinical stage and lymph node metastasis（r = 0.332， 0.329， P < 0.05）. Conclusion AR， P-PKB expression have a great significance in triple negative breast cancer， can be used as an important indicator of prognosis， and they are expected to become new targets in treatment of triple negative breast cancer.

[Key words] Androgen receptor； Phosphorylated protein kinase B； Triple negative breast cancer； Expression

三阴性乳腺癌是指孕激素受体（PR）阴性、雌激素受体（ER）阴性以及人类表皮生长因子受体2（HER2）低表达的乳腺癌，是一种被认为独立的临床病理类型，其占乳腺癌的15%～20%[1]。相比其他类型乳腺癌，三阴性乳腺癌预后性差，肿瘤分级高，且更容易复发[2-3]。靶向治疗及内分泌治疗对三阴性乳腺癌的治疗效果差，目前，放化疗是其主要治疗手段，但是治疗效果仍然不太理想[4]，因此，三阴性乳腺癌临床治疗方案的制订一直是临床医师的重大挑战。雄激素是性激素的一种，雄激素受体（AR）及其配体雄激素在乳腺生物学上及致癌作用上扮演重要角色[5]。蛋白激酶B（PKB）属于丝氨酸/苏氨酸激酶，是一种信号转导蛋白，磷酸化蛋白激酶B（P-PKB）即活化的PKB，其在促进细胞异常繁殖分化、促进癌症的发生发展中扮演重要角色[6]。基于以上分析，本研究通过分析三阴乳腺癌患者与非三阴乳腺癌患者及三阴乳腺癌不同分期患者间的AR、P-PKB的表达情况，以探讨AR、P-PKB在三阴性乳腺癌的表达意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2012年3月～2015年3月惠州市中心人民医院（以下简称“我院”）收治的三阴性乳腺癌患者54例，均经病理学检查以及免疫组化染色确认，以ER、PR阴性及HER2低表达定义为三阴性乳腺癌。所有患者均为女性，年龄30～75岁，平均（52.34±8.93）岁；临床分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期29例，Ⅲ期18例；肿瘤≥5 cm 8例，

1.2 纳入标准及排除标准

纳入标准：①有完整的临床资料，包括一般情况、治疗方式、肿瘤大小、病理诊断等；②未行新辅助化疗；③签属知情同意书者。

排除标准：①入院时生命体征不平稳患者；②远处脏器转移者；③携带肝炎病毒患者，或严重肝、肾等脏器功能不全患者；④合并其他恶性肿瘤者；⑤手术禁忌或过敏体质者。

1.3 主要仪器与试剂

石蜡切片机（Thermo Shandon Ltd.，Finesse E型号），显微镜（上海彼爱姆，XSP-BM-2CB型号），离心机（山东博科生产，BK-TDZ5型号），免疫组织修复盒（北京驰明瑞生物科技有限公司，18孔规格），蛋白激酶B多克隆抗体（上海钰博公司，1 mg/mL），雄激素受体（AR）多克隆抗体（上海钰博公司，1 mg/mL），自制PBS缓冲液，自制柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0），自制0.3%过氧化氢溶液等。

1.4 检测方法

采用免疫组化S-P法检测AR、P-PKB表达，严格根据试剂盒说明书标准进行操作。对115份包埋肿瘤石蜡块进行连续切片，每张切片厚度为4 μm，置于60℃烤箱中石蜡包埋切片脱蜡（烤箱内放置120 min），切片脱蜡置水，采用柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）进行抗原修复，将其于过氧化氢溶液（浓度为0.3%）中浸入10 min，阻断内源化过氧化氢酶的活性，然后再采用10%正常血清封闭，放置于室温孵育10 min，滴加雄激素受体（AR）多克隆抗体、蛋白激酶B多克隆抗体，放置于4℃下过夜，滴加生物素标记的二抗，再放置于37℃温箱孵育20 min，再滴加辣根酶标记链霉素的三抗，再放置于37℃温箱孵育20 min，DAB染色。显微镜观察。

1.5 结果观察与判断标准

AR的阳性表达主要依据是细胞核内是否出现染色为棕褐色颗粒沉积。在400倍镜视野下随机选择5个不同视野进行计数，对选定视野中的肿瘤细胞总数和AR阳性肿瘤细胞数进行计数，并计算AR阳性肿瘤细胞百分比，再求5个视野的平均值作为判断的结果，根据文献评价标准[7]，将AR阳性肿瘤细胞百分比分为四个等级，

P-PKB的阳性表达主要依据是细胞质内是否出现染色为棕黄色颗粒分布。在400倍视野下随机选择5个不同视野进行计数，对选定视野中的肿瘤细胞总数和P-PKB阳性肿瘤细胞数进行计数，并计算P-PKB阳性肿瘤细胞百分比，再求5个视野的平均值作为判断的结果，根据文献评价标准[8]，将P-PKB阳性肿瘤细胞百分比分为四个等级，

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0进行数据统计处理，，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料以率表示，采用χ2检验。对肿瘤临床分期、淋巴结转移情况与AR和P-PKB的相关性情况采用Spearman相关分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AR和P-PKB在乳腺癌组织中表达

三阴性乳腺癌的AR阳性表达率明显低于非三阴性乳腺癌（P < 0.05）；三阴性乳腺癌的P-PKB阳性表达率明显高于非三阴性乳腺癌（P < 0.05）。见表1。

2.2 三阴性乳腺癌组织中AR表达与临床病理参数相关性

三阴性乳腺癌组织中AR的表达与临床分期和淋巴结转移情况呈显著负相关（P < 0.05）。见表2。

2.3 三阴性乳腺癌组织中P-PKB表达与临床病理参数相关性

三阴性乳腺癌组织中P-PKB的表达与临床分期和淋巴结转移情况呈显著正相关（P < 0.05）。见表3。

3 讨论

三阴性乳腺癌是基底细胞样型中的一类乳腺癌，其远处转移率较高，患者容易出现骨转移、内脏转移及脑转移[9-10]，因此，在所有类型的乳腺癌中，三阴性乳腺癌是预后性较差，肿瘤分级较高，最容易复发的一类乳腺癌[11-12]。现阶段，三阴性乳腺癌缺乏有效的治疗手段，靶向治疗及内分泌治疗几乎无效，而放化疗治疗也难以取得十分满意的效果[13-14]。为了寻找三阴性乳腺癌有效的治疗手段，众多学者开始从一些肿瘤细胞分子标志物入手研究了一些新的治疗手段，如表皮生长因子受体抑制剂、抗血管生成抑制等等[15-16]，但是这些新的治疗手段的有效性尚未得到大量临床试验数据的支持。为此，本研究想通过分析AR与P-PKB在三阴乳腺癌患者中的表达情况，来探讨AR与P-PKB在三阴性乳腺癌患者病情发展中的作用机制，以期发现三阴乳腺癌治疗的新靶点。

雄激素是一种性激素，AR是雄激素作用的中介物质，属于细胞核内的X染色体上基因所编码的核受体，根据相关研究显示[17]，AR及其配体雄激素在乳腺癌形成与发展中扮有重要角色。本研究结果发现，54例三阴性乳腺癌患者中AR阳性表达率为48.14%，这也与相关报道一致。研究结果还显示，三阴性乳腺癌患者的AR阳性表达率明显低于非三阴性乳腺癌患者（P < 0.05），这说明在三阴性乳腺癌患者中AR阳性表达率较低，而在Qi等[18]的研究结果中，证实AR的阳性表达与ER和PR表达呈现正相关性，这解释了本研究中三阴性乳腺癌患者中AR阳性表达率较低的原因。目前，ER和PR已经成为公认的判断乳腺癌恶化程度的权威指标，而AR的阳性表达又与ER和PR有一定的关联性，因此，AR的阳性表达也可能作为预后的重要指标。本研究结果显示，三阴性乳腺癌组织中AR的表达与临床分期和淋巴结转移情况呈显著负相关（P < 0.05），这说明AR阴性患者肿瘤组织临床分期较高且易于发生淋巴结转移，而AR阳性患者肿瘤组织临床分期较低且不易发生淋巴结转移，这也正好证明了AR的阳性表达可以作为三阴乳腺癌患者的预后的重要指标，究其原因，可能是因为AR在抑制乳腺癌细胞增殖中起到了一定的作用，阻止了乳腺原位癌向浸润性癌的转变。另外，干扰AR信号通路可能对治疗三阴性乳腺癌患者具有一定的积极意义，因此，AR也有可能成为未来治疗三阴性乳腺癌的新靶点。

PKB属于丝氨酸/苏氨酸激酶，是一种信号转导蛋白，P-PKB即活化的PKB，其在促进细胞异常繁殖分化、促进癌症的发生发展中扮有重要角色，已有研究显示[19-20]，许多肿瘤的发生与发展与P-PKB的表达密切相关，但是目前还未有关于三阴性乳腺癌患者P-PKB的表达情况的研究[21]。本文研究结果显示，三阴性乳腺癌患者的P-PKB阳性表达率明显高于于非三阴性乳腺癌患者（P < 0.05），说明三阴性乳腺癌具有P-PKB阳性高表达性，而P-PKB阳性高表达性又导致肿瘤组织细胞的繁殖分化，这也决定了三阴性乳腺癌预后性差、肿瘤分级高、易复发等特征。本文的研究结果也在一定程度上证实了以上推论，研究结果显示，阴性乳腺癌组织中P-PKB的表达与临床分期和淋巴结转移情况呈显著正相关（P < 0.05），说明P-PKB阳性高表达三阴性乳腺癌患者的肿瘤临床分期较高且易于发生淋巴结转移，而P-PKB阴性及阳性低表达三阴性乳腺癌患者的肿瘤临床分期较低且不易发生淋巴结转移。综合以上分析，三阴性乳腺癌患者中P-PKB表达情况可以作为三阴性乳腺癌患者的一项重要预后指标。另外，P-PKB阳性高表达是由于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/PKB信号通路异常活化引起，PI3K/PKB信号通路的活化又与唯一的抑癌基因PTEN缺失密切相关，而以目前的医疗技术，还无法解决基因缺失引起的疾病，唯一能做到的就是降低PI3K/PKB信号通路的活化状态，降低P-PKB的阳性表达，因此，P-PKB也有望成为治疗三阴性乳腺癌的新靶点。

综上所述，AR、P-PKB在三阴性乳腺癌的表达具有重要的意义，可以作为预后的重要指标，并有望成为未来治疗三阴性乳腺癌的新靶点。

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（收稿日期：2015-12-08 本文编辑：苏 畅）